抗甲型流感病毒卵黃抗體的制備、活性評價(jià)及其應(yīng)用研究.pdf

1、由于甲型流感病毒變異快、抗甲流病毒的化學(xué)藥物毒副作用大，易產(chǎn)生耐藥性，同時(shí)有效疫苗的制備難度很大，因此尋找一種安全、簡便、高效的甲型流感防治藥物成為目前具有挑戰(zhàn)性的研究課題。
　　卵黃抗體(Eggyolk immunoglobulin，IgY)具有來源廣、特異性好、安全無殘留、性能穩(wěn)定及價(jià)格合理等優(yōu)點(diǎn)，在病毒性疾病的預(yù)防、治療和診斷方面具有廣闊的應(yīng)用前景。
　　本課題采用滅活甲型流感病毒為抗原免疫產(chǎn)蛋雞，制備特異性IgY，對

2、IgY的體內(nèi)外抗病毒活性及其在甲型流感病毒檢測中的應(yīng)用進(jìn)行研究，為特異性IgY在甲型流感的預(yù)防、治療及檢測方面的應(yīng)用提供理論依據(jù)。
　　研究內(nèi)容分為四部分:
　　1.抗甲型流感病毒卵黃抗體的制備
　　1.1 以滅活甲型H1N1流感病毒A/廣東/732/2009(H1N1)pdm09和A/加利福尼亞州/7/2009(H1N1)pdm09毒株及季節(jié)性甲型流感病毒A/廣東/622/2009(H1N1)和A/廣東/749/20

3、09(H3N2)毒株為抗原分別免疫蛋雞獲得特異性IgY。采用PEG沉淀法得到IgY純度95.80％，回收率93.01％。
　　1.2 經(jīng)ELISA檢測，不同抗原免疫產(chǎn)生的抗體效價(jià)隨時(shí)間的變化趨勢基本一致，1mg/mL的IgY的最高效價(jià)達(dá)3200，最高效價(jià)在卵黃中可持續(xù)6周，高效價(jià)抗體(＞2500)在卵黃中可持續(xù)10周以上。
　　2.抗甲型H1N1流感病毒卵黃抗體的體外活性評價(jià)
　　主要對抗甲型H1N1流感病毒A/廣東/

4、732/09(H1N1)pdm09 IgY的抗病毒活性進(jìn)行了分子水平和細(xì)胞水平上的評價(jià)。
　　2.1 瓊脂擴(kuò)散和熒光免疫實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明IgY能與病毒顆粒結(jié)合并使其產(chǎn)生沉淀; Western Blot分析和HI實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示IgY能與病毒表面的主要膜蛋白神經(jīng)氨酸酶(NA)、血凝素(HA)、核蛋白(NP)及基質(zhì)蛋白(M)發(fā)生特異性結(jié)合，能有效抑制病毒對紅細(xì)胞的凝集作用，1.0mg/mL的IgY能完全抑制紅細(xì)胞凝集的最高稀釋倍數(shù)為128

5、。
　　2.2 空斑減數(shù)試驗(yàn)，結(jié)果說明IgY能有效中和病毒，直接抑制病毒對宿主細(xì)胞的吸附，IC50＜2.0μg/mL;能有效阻止病毒吸附于細(xì)胞;能抑制細(xì)胞內(nèi)病毒的復(fù)制增殖;體外抗病毒作用明顯、穩(wěn)定。
　　3.抗甲型H1N1流感病毒卵黃抗體的小鼠體內(nèi)抗病毒活性研究
　　3.1 IgY對A/廣東/732/2009(H1N1)pdm09感染小鼠的死亡保護(hù)作用將BALB/C小鼠隨機(jī)分為15組，正常組，模型組，磷酸奧司他韋治療組

6、，抗A/廣東/732/09(H1N1)pdm09μgY預(yù)防組（含大、中、小劑量3組）、治療組（含大、中、小劑量3組）和預(yù)防-治療組（含大、中、小劑量3組），陰性IgY中劑量預(yù)防組、治療組和預(yù)防-治療組。以5LD50的流感病毒液每只50.0μL滴鼻感染小鼠造模，正常組以生理鹽水滴鼻對照。預(yù)防組在感染前2h給藥1次;治療組自感染后2h開始給藥，每天1次，持續(xù)給藥4天;預(yù)防-治療組感染前2h給藥1次，其他給藥同治療組。自造模當(dāng)日起連續(xù)觀察2周

7、，計(jì)算各組存活率及體重保持率。結(jié)果顯示:
　　①模型組和陰性IgY各組的存活率都為10％。特異性IgY各組存活率≥90％，與模型相比較有極顯著性差異，P＜0.001。
　?、谀Ｐ徒M和陰性IgY各組的小鼠體重均先下降，后緩慢上升，顯著低于正常組。特異性IgY各組體重明顯高于模型組。特異性IgY中劑量治療組的體重變化和存活率與磷酸奧司他韋治療組無差異。
　　3.2 IgY對A/廣東/732/09(H1N1)pdm09感染小

8、鼠肺損傷及病毒增殖的影響
　　將BALB/C小鼠隨機(jī)分為6組，正常組，模型組，磷酸奧司他韋治療組，抗A/廣東/732/09(H1N1)pdm09 IgY中劑量預(yù)防組、治療組和預(yù)防-治療組。分別在感染后第3天和第6天隨機(jī)處死小鼠，摘取肺臟。計(jì)算肺指數(shù)與肺指數(shù)抑制率，應(yīng)用RT-PCR測定感染小鼠肺組織病毒載量，HA實(shí)驗(yàn)測定感染小鼠肺組織病毒滴度，HE染色光鏡觀察感染小鼠肺部組織的病理學(xué)變化。結(jié)果顯示:
　　①各個(gè)時(shí)間點(diǎn)，模型組與

9、IgY各組的肺指數(shù)均有上升趨勢，但I(xiàn)gY各組肺指數(shù)明顯低于模型組。感染后第3天，IgY各組與模型組相比有顯著性差異，P＜0.05;感染后第6天，IgY各組與模型組相比較有極顯著性差異，P＜0.01。
　　②各個(gè)時(shí)間點(diǎn)，模型組小鼠肺組織病毒載量和病毒滴度都明顯高于IgY各組。IgY預(yù)防-治療組與模型組相比較，具有極顯著差異，P＜0.001;其他各組與模型組相比較，均具有極顯著性差異，P＜0.01。
　　③在病理組織切片中，Ig

10、Y各組的肺組織結(jié)構(gòu)基本完整，壞死與浸潤級(jí)別低。
　　4.甲型H1N1流感病毒表面增強(qiáng)拉曼光譜免疫分析方法的建立與應(yīng)用
　　以檸檬酸三鈉為還原劑成功制備金溶膠;用4,4'-聯(lián)吡啶作為拉曼標(biāo)記分子對金溶膠進(jìn)行標(biāo)記制備標(biāo)記金溶膠;用IgY與標(biāo)記金溶膠結(jié)合制備標(biāo)記免疫金溶膠;標(biāo)記免疫金溶膠與標(biāo)記金溶膠的SERS圖譜相一致。采用硅烷化、醛基化的方法在凹形載玻片上進(jìn)行IgY的組裝，制備固相抗體。
　　優(yōu)化實(shí)驗(yàn)步驟，建立表面增強(qiáng)拉曼