抗諾如病毒雞卵黃抗體的制備及其初步應(yīng)用研究.pdf

1、研究背景:諾如病毒(Nov)與札幌樣病毒(SLV)合稱為人類杯狀病毒(Calicivirus)。該病毒是于1972年，由Kapikian在1968年美國(guó)Norwalk地區(qū)暴發(fā)的急性胃腸炎患者的糞便中采用免疫電鏡法檢測(cè)出來的球狀病毒顆粒，直徑在27-32nm之間。如今，Nov已成為非細(xì)菌性急性胃腸炎的主要病原體?？稍谟變簣@、夏令營(yíng)、學(xué)校、醫(yī)院、養(yǎng)老院、餐館、部隊(duì)（航海艦隊(duì)）與游船等小型單位引起暴發(fā)，所有年齡段均可被感染。對(duì)新世紀(jì)多次暴發(fā)的

2、腹瀉病原分析發(fā)現(xiàn)，GⅡ型Nov已成為全球病毒性胃腸炎最常見的Nov病毒株，其中GⅡ.4型Nov毒株占主導(dǎo)地位。目前主要采用RT-PCR法檢測(cè)食物、糞便和水中的Nov，此法敏感性較高、重復(fù)性好，但耗時(shí)較長(zhǎng)，儀器設(shè)備要求較高。且由于毒株的多樣性，RT-PCR必須要使用混合引物。如今，RT-PCR已逐漸被熒光定量PCR取代，后者更加快速和靈敏，特別是使用Taqman探針時(shí)，單次試驗(yàn)即可提供證據(jù)并進(jìn)行定量檢測(cè)，但此法儀器設(shè)備要求高，很難在現(xiàn)場(chǎng)和

3、基層普及。
　　 禽類血液中的抗體IgG可轉(zhuǎn)移到卵黃液中，并在胚胎發(fā)育過程中對(duì)潛在的各種病原體感染起到被動(dòng)保護(hù)作用，這種抗體稱為卵黃抗體即IgY。IgY是存在于禽蛋卵黃中的主要抗體，屬多克隆抗體，在疾病診斷和防治的應(yīng)用方面有許多優(yōu)點(diǎn)。通過免疫血清的途徑一次性制備大量抗體是相當(dāng)困難的，且多次制備會(huì)導(dǎo)致抗體的均一性差。產(chǎn)蛋雞經(jīng)免疫后，可從其卵黃不斷獲得特異性抗體。IgY具有特異性強(qiáng)、純度高等優(yōu)點(diǎn)，不會(huì)與哺乳動(dòng)物產(chǎn)生過敏反應(yīng)或交叉血清

4、反應(yīng)，可替代通過免疫兔、小鼠等哺乳動(dòng)物而進(jìn)行抗體的大量生產(chǎn)。近年來，IgY的研究和應(yīng)用已經(jīng)成為免疫學(xué)領(lǐng)域的熱點(diǎn)。Woolley等用重組人白細(xì)胞介素-6分別對(duì)羊和雞進(jìn)行免疫，制備了IgG和IgY，發(fā)現(xiàn)兩者對(duì)人白細(xì)胞介素-6都有很高的親和力，表明IgY可以代替哺乳動(dòng)物的IgG進(jìn)行免疫檢測(cè)。2003年，de-Almeida CM制備了抗BfpA IgY應(yīng)用于免疫吸附，發(fā)現(xiàn)其可以特異性地鑒定EPEC。Ohnishi T等用IgY與IgG進(jìn)行EL

5、ISA檢測(cè)HGF，發(fā)現(xiàn)IgY使靈敏度提高了10倍，不但能檢測(cè)出血中的HGF，還能檢測(cè)正常人尿中的HGF。Juliarena等表達(dá)了GST-p24融合蛋白，再以此免疫蛋雞制備了特異性IgY用于免疫診斷。結(jié)果表明用IgY檢測(cè)可避免常規(guī)的哺乳動(dòng)物二抗所帶來的交叉反應(yīng)。IgY作為檢測(cè)試劑用于一系列的分析技術(shù)，將有望更多的應(yīng)用于診斷試劑的領(lǐng)域，在診斷試劑的開發(fā)中發(fā)揮重要作用。
　　 本研究用GⅡ.4型387型菌株Nov P顆粒蛋白抗原作為

6、抗原免疫產(chǎn)蛋來航雞制備抗Nov卵黃抗體IgY，在此基礎(chǔ)上對(duì)IgY進(jìn)行HRP酶標(biāo)制備酶標(biāo)抗體，建立用于檢測(cè)Nov的雙抗體夾心ELISA體系，并進(jìn)行評(píng)價(jià)。為IgY今后在診斷和疾病防治方面的應(yīng)用奠定一定基礎(chǔ)，并為Nov的檢測(cè)和防治提供新的思路。
　　 研究目的和內(nèi)容:
　　 1.制備特異性抗Nov卵黃抗體IgY。
　　 2.研究特異性抗Nov卵黃抗體IgY的特性。
　　 3.利用特異性抗Nov卵黃抗體IgY建立

7、雙抗體夾心ELISA體系用于Nov的檢測(cè)，并對(duì)其進(jìn)行初步應(yīng)用評(píng)價(jià)。
　　 方法:
　　 1.抗Nov雞卵黃抗體IgY的制備
　　 (1)采用GⅡ.4型387型菌株Nov P顆粒蛋白抗原與等量弗氏佐劑乳化制備免疫制劑，采用多次多點(diǎn)雙翅下肌肉注射的方式免疫產(chǎn)蛋來航雞;
　　 (2)收集免疫前一周及免疫后三個(gè)月內(nèi)的雞蛋;
　　 (3)改良水稀釋法和硫酸銨兩次分級(jí)沉淀法（終飽和度分別為55％和33％）分離

8、、純化雞卵黃抗體;
　　 (4)間接ELISA法檢測(cè)雞IgY各周期的效價(jià)變化;
　　 (5) SDS-PAGE電泳鑒定雞IgY的純度，Western blot法鑒定雞IgY的特異性;
　　 (6)考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定雞卵黃抗體中的總蛋白含量;
　　 (7)將卵黃抗體溶液稀釋成不同濃度置于25℃室溫環(huán)境下評(píng)價(jià)其室溫穩(wěn)定性;在不同pH環(huán)境下作用評(píng)價(jià)其pH穩(wěn)定性;在不同溫度下處理評(píng)價(jià)其熱穩(wěn)定性;將其用不同pH環(huán)境的

9、胃蛋白酶進(jìn)行處理，評(píng)價(jià)胃蛋白酶對(duì)雞卵黃抗體的影響;在-20℃與4℃環(huán)境下反復(fù)凍融5次，評(píng)價(jià)反復(fù)凍融對(duì)其的影響。
　　 2.基于抗Nov雞卵黃抗體的ELISA檢測(cè)體系的建立及評(píng)價(jià)
　　 (1)采用過碘酸鈉法對(duì)抗Nov雞卵黃抗體IgY進(jìn)行酶標(biāo)制備酶標(biāo)抗體;
　　 (2)采用280nm下的紫外吸收法測(cè)定酶標(biāo)抗體的蛋白含量，并計(jì)算其標(biāo)記率、克分子比值;
　　 (3)利用上述獲得的酶標(biāo)抗體建立雙抗體夾心ELISA檢

10、測(cè)體系;
　　 (4)對(duì)所建立的雙抗體夾心ELISA檢測(cè)體系的各個(gè)條件進(jìn)行優(yōu)化;
　　 (5)評(píng)價(jià)所建立的雙抗體夾心ELISA體系的最低檢出限、與輪狀病毒和腺病毒的交叉反應(yīng)、批內(nèi)變異系數(shù)及批間變異系數(shù);
　　 (6)將所建立的雙抗體夾心ELISA檢測(cè)體系與金標(biāo)準(zhǔn)RT-PCR加測(cè)序法比較，對(duì)其進(jìn)行臨床應(yīng)用評(píng)價(jià)，計(jì)算靈敏度、特異度及約登指數(shù)。
　　 結(jié)果:
　　 1.抗諾如病毒雞卵黃抗體IgY的制備<

11、br>　　 (1)改良水稀釋法加硫酸銨兩次分級(jí)沉淀法分離、純化的抗Nov雞卵黃抗體的效價(jià)在第一次加強(qiáng)免疫后迅速上升，到首次免疫后的第五周效價(jià)達(dá)到最高為1∶51200，后慢慢下降穩(wěn)定至1∶12800。
　　 (2) SDS-PAGE結(jié)果顯示純度較好，條帶主要集中在66KDa和33KDa左右，雜帶較少。Western blot結(jié)果顯示所制備的雞卵黃抗體IgY可與GⅡ.4型387型菌株Nov P顆粒蛋白抗原發(fā)生特異性結(jié)合。
　

12、　 (3)考馬斯亮藍(lán)法測(cè)得雞卵黃抗體IgY溶液的總蛋白含量為7.2mg/ml蛋黃液。
　　 (4)理化性質(zhì)評(píng)價(jià)結(jié)果為不同稀釋梯度的雞卵黃抗體在25℃室溫下保存三個(gè)月，IgY效價(jià)略有下降，但依然可保持較高活性。在60℃及以下的溫度環(huán)境處理30min后，抗體活性變化不大;在70℃環(huán)境溫度處理30min時(shí)，活性稍有下降;IgY抗體在80℃環(huán)境下處理30min后，活性基本消失。雞卵黃抗體IgY在pH3-12范圍內(nèi)活性基本不受影響，而當(dāng)

13、pH值≤2或≥12時(shí)抗體活性快速下降。IgY抗體在pH≥3的胃蛋白酶作用下，活性稍有下降，在pH≤2的胃蛋白酶作用下，活性消失。IgY抗體在-20℃與4℃之間反復(fù)凍融后，活性稍有下降，但幅度較小。
　　 2.基于抗諾如病毒雞卵黃抗體的ELISA檢測(cè)體系的建立及評(píng)價(jià)
　　 (1)制得的HRP酶標(biāo)IgY抗體克分子比為1.74，標(biāo)記率為48.73％。蛋白含量為8.58606mg/ml。
　　 (2)對(duì)所建立雙抗體夾心E

14、LISA體系的各個(gè)條件進(jìn)行優(yōu)化得最佳包被稀釋度和最佳酶標(biāo)抗體稀釋度均為1∶80，最優(yōu)封閉液為2％BSA，封閉時(shí)間為1小時(shí)，最佳酶標(biāo)抗體反應(yīng)時(shí)間為30min，最佳底物作用時(shí)間為15min。
　　 (3)對(duì)所建立雙抗體夾心ELISA體系進(jìn)行評(píng)價(jià)得最低檢測(cè)限為20ng/ml，批內(nèi)變異系數(shù)為1.021％，批間變異系數(shù)為1.150％，與輪狀病毒和腺病毒之間存在反應(yīng)率較低的交叉反應(yīng)。
　　 (4)所建立的雙抗體夾心ELISA體系與金

15、標(biāo)準(zhǔn)相比，檢出率無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，吻合系數(shù)Kappa=0.637，P=0.000，吻合度一般。臨床應(yīng)用評(píng)價(jià)計(jì)算得靈敏度為82.50％，特異度為81.82％，約登指數(shù)為0.6432。
　　 結(jié)論:
　　 1.以GⅡ.4型387型菌株諾如病毒P顆粒蛋白抗原多次多點(diǎn)免疫產(chǎn)蛋來航雞，成功制備了抗諾如病毒的卵黃抗體IgY，效價(jià)最高可達(dá)1∶51200。
　　 2.SDS-PAGE電泳顯示，卵黃抗體純度較高，雜帶較少，電泳條帶主要

16、集中在66KDa和33KDa處，Western blot顯示IgY對(duì)蛋白抗原的特異性較好。
　　 3.改良水稀釋法加硫酸銨兩步分級(jí)沉淀法分離、純化雞蛋黃中的抗Nov特異性IgY，具有簡(jiǎn)便、快捷、高效的優(yōu)點(diǎn)，制得的IgY抗體活性較高，適合于IgY的大規(guī)模提取。
　　 4.獲得的IgY抗體對(duì)溫度、酸堿度的穩(wěn)定性較好，在室溫下穩(wěn)定。在胃蛋白酶作用下或反復(fù)凍融，活性稍有下降。
　　 5.用HRP標(biāo)記卵黃抗體IgY，成功制

17、備了以IgY為基礎(chǔ)的酶標(biāo)抗體。
　　 6.以特異性抗Nov抗體IgY作為包被抗體，以酶標(biāo)抗體為捕獲抗體，建立了用于檢測(cè)Nov的雙抗體夾心ELISA體系。對(duì)其條件進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)果如下:
　　 (1)包被抗體與捕獲抗體的最佳工作稀釋濃度均為1∶80。
　　 (2)封閉液選取:2％BSA，封閉時(shí)間:1小時(shí)。
　　 (3)酶標(biāo)抗體最佳反應(yīng)時(shí)間:30分鐘。
　　 (4)底物最佳作用時(shí)間:15分鐘。