抗諾如病毒藥物篩選的相關(guān)基礎(chǔ)及其有效方藥的文獻研究.pdf

1、諾如病毒(NoV)是全球范圍內(nèi)引起成人和兒童非菌性急性胃腸炎暴發(fā)流行的重要病原體,同時也是嬰幼兒散發(fā)性胃腸炎的常見病原(僅次于輪狀病毒),無論發(fā)達國家還是發(fā)展中國家,NoV都有很高的感染率。美國疾病控制中心(CDC)曾經(jīng)估計,美國每年有至少2300萬例NoV導(dǎo)致的胃腸炎病例(約占其人口總數(shù)的10％),占到所有已知病原體導(dǎo)致疾病總數(shù)的60％,有超過73％到95％的傳染性胃腸炎暴發(fā)是由NoV造成的,每年因NoV胃腸炎的治療費用和間接經(jīng)濟損失

2、達3.5至7.5億美元。據(jù)前些年統(tǒng)計,在我國,腹瀉病是位居第二位的對小兒威脅較大的常見多發(fā)病,其中病毒性腹瀉占40％以上,由NoV引起的腹瀉估計占1/3。實際上,過去由于未列入常規(guī)檢測或報告項目,對該病毒感染和發(fā)病的的危害仍被嚴重低估。
　　 NoV基因組屬于單股正鏈RNA,全長約7.5～7.7kb,包括3個開放閱讀框(ORFs)·ORF2編碼的含540個氨基酸的主要衣殼蛋白VP1為NoV抗原主要決定簇,同時負責識別結(jié)合受體,近

3、年來已成為NoV的主要研究對象。NoV具有高度遺傳多樣性,不同國家、社區(qū)同時可能存在不同的NoV毒株流行。自20世紀90年代中期首次確認GⅡ-4型NoV毒株導(dǎo)致絕大部分NoV胃腸炎暴發(fā)和世界性大流行后,NoV GⅡ-4型毒株一直為為全球優(yōu)勢流行株。我們課題組南方醫(yī)科大學公衛(wèi)學院流行病學系自2002年以來對廣東省多地NoV感染進行了前瞻性流行病學研究,結(jié)果表明NoV GⅡ-4型為主要流行株,占到總數(shù)的82.9％,該結(jié)果得到了北京、長春、濟

4、南、蘭州、福州等地NoV研究的證實。
　　 由于缺乏細胞培養(yǎng)系統(tǒng),亦無合適的動物感染模型,一直以來抗NoV胃腸炎的藥物研究進展緩慢,迄今為止,尚缺乏針對NoV胃腸炎的有效抗病毒藥物和疫苗。近年來隨著國外學者對NoV基因組結(jié)構(gòu)和發(fā)病機制研究的日益深入,發(fā)現(xiàn)了一些具有前景的抗NoV藥物靶標,如:通過多糖受體阻斷病毒與宿主細胞相互作用、抑制病毒蛋白水解酶和多聚酶作用和抑制病毒復(fù)制等方面。這些進展為抗NoV性胃腸炎的藥物研究提供了新思路

5、。
　　 本研究擬在前期工作基礎(chǔ)上,以我國NoV流行優(yōu)勢株GⅡ-4型毒株為主要研究對象,以NoV入侵人體的主要致病蛋白VP1及其所識別的人類組織血型抗原(HBGAs)受體為研究切入點,克隆GⅡ-4型NoV ORF2基因,利用桿狀病毒表達系統(tǒng)(Bac-to-Bac)表達純化GⅡ-4型病毒樣顆粒(VLP),在此基礎(chǔ)上,采用凝集抑制實驗法測定唾液HBGAs受體分型(A、B、H),建立一種體外NoVVLPs結(jié)合唾液HBGAs受體的酶聯(lián)免

6、疫(EIA)藥物篩選模型。
　　 中醫(yī)藥治療病毒性腹瀉歷史悠久、經(jīng)驗豐富、療效肯定,且自成體系。近年來中醫(yī)藥界為尋求有效的療法進行了多方探索,各地涌現(xiàn)出大量自擬新方,經(jīng)臨床和實驗證實具有獨特的優(yōu)勢和廣闊的開發(fā)前景。本研究通過收集中醫(yī)藥治療病毒性腹瀉的現(xiàn)代有關(guān)文獻,試圖通過對病毒性腹瀉有效方劑之基本結(jié)構(gòu)和核心藥物的深入分析,篩選出具有研究前景的候選藥物,并擬定更加合理和可行的中醫(yī)治療方案,以期為利用此模型進行針對性的高通量抗NoV

7、中藥化合物篩選奠定文獻基礎(chǔ)。
　　 一、GⅡ-4型諾如病毒ORF2基因的克隆與序列分析
　　 從三株GⅡ-4型NoV糞便中(GZ-55,GZ-121,JM-482)提取病毒RNA,經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄后,以cDNA為模板,PCR擴增出完整ORF2基因,分別與PMD18-T載體連接,得到重組質(zhì)粒PMD18-T-GZ55 ORF2,PMD18-T-GZ121 ORF2,PMD18-T-JM482 ORF2。DNA測序后進行全部核苷酸、氨

8、基酸序列分析比較和進化樹分析。結(jié)果表明:根據(jù)GenBank公布的GⅡ-4型NoV保守序列設(shè)計合成特異性引物,3株GZ-55,GZ-121,JM-482 NoV糞便標本通過RT-PCR均得到約1.7kb分子量大小ORF2區(qū)域片斷,其長度與預(yù)計相符。重組質(zhì)粒行BamHⅠ和HindⅢ雙酶切后PCR擴增出完整ORF2閱讀框序列(約1.62kb)。利用DNAstar軟件分析該3株NoV ORF2序列,其中GZ55、GZ121 ORF2共1620個

9、堿基編碼539個氨基酸,JM482 ORF2共1623個堿基編碼540個氨基酸。GZ55、GZ121和JM482與VA387氨基酸同源性分別為92％、93％、93％。經(jīng)與Genbank代表性NoV GⅠGⅡ的ORF2氨基酸比較分析,結(jié)果表明:NoV ORF2包括2個主要區(qū)域,N端結(jié)尾的殼區(qū)域(S區(qū)域)和C端結(jié)尾的突出區(qū)域(P區(qū)域)；其編碼的氨基酸序列存在3個相對保守序列:S區(qū)與P區(qū)結(jié)合部位的FLVPPTVE序列、P1亞區(qū)KT或RT氨基酸

10、序列、P區(qū)域C末端保守精氨酸R簇。結(jié)合文獻分析這些保守序列均具有不同的重要作用:含F(xiàn)LVPPTVE鉸鏈的P二聚體和HBGAs受體結(jié)合力低而不含鉸鏈的P顆粒結(jié)合HBGAs受體能力非常強；P1亞區(qū)KT或RT氨基酸序列為胰島素酶切位點；C末端保守精氨酸R簇在識別受體過程是必需的。
　　 二、ORF2基因在昆蟲細胞中表達形成病毒樣顆粒的研究
　　 用限制性內(nèi)切酶BamHⅠ和HindⅢ將質(zhì)粒PMD18-T-GZ121 ORF2酶切

11、,回收酶切的目的基因ORF2片段,再與用BamHⅠ和HindⅢ酶切的線性化載體PFastBacTM1連接,獲得重組轉(zhuǎn)座載體pFastBac-GZ121 ORF2,將其轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH10Bac,得到重組桿狀病毒穿梭質(zhì)粒rBacmid-GZ121 ORF2,經(jīng)用瓊脂糖凝膠電泳和PCR.鑒定后,將其轉(zhuǎn)染昆蟲Sf9細胞,從培養(yǎng)上清中獲得重組桿狀病毒rBac-GZ121 ORF2,以之重新感染新鮮的Sf9細胞表達外源蛋白。對細胞上清進行SDS-

12、PAGE和Western.blot分析,發(fā)現(xiàn)重組病毒rBac-GZ121 ORF2表達了分子量約為58KDa的NoV衣殼蛋白,大小與VLP相符,說明桿狀病毒攜帶的NoV衣殼蛋白基因ORF2在昆蟲細胞中得到成功表達。對細胞上清采用不連續(xù)蔗糖密度梯度超速離心,純化出VLP并經(jīng)負染電鏡得到證實,其直徑約為30nm,形態(tài)和結(jié)構(gòu)與野生型NoV相同。為進一步研究VLP的各種特性打下了物質(zhì)基礎(chǔ)。
　　 三、病毒樣顆粒結(jié)合唾液HBGAs受體的檢

13、測及意義
　　 收集健康志愿者唾液標本,采用凝集抑制實驗法檢測唾液中HBGAs血型物質(zhì),用EIA法檢測NoV-VLP與HBGAs的結(jié)合特性。結(jié)果顯示,63份唾液標本檢出O型21例(占33.3％),B型14例(占22.2％),A型和非分泌型各13例(分別占20.6％),AB型2例(占3.2％)。NoV-VLP與A、B、O型均能結(jié)合(OD值>2.5),與非分泌型唾液不結(jié)合(OD值～0.3),結(jié)合方式與rVA387相一致,其與受體結(jié)合

14、的特異性也再次表明我們成功在昆蟲細胞中表達了VLP。針對NoV結(jié)構(gòu)蛋白VP1的HBGAs受體阻斷劑的篩選和開發(fā)具有更為廣闊的研究前景和現(xiàn)實意義。本研究建立的NoV-VLP和HBGAs受體結(jié)合模型,重復(fù)性好,且具有快速經(jīng)濟等優(yōu)點,為開發(fā)我國人群NoV暴發(fā)的防治藥物提供了理想篩選模型。
　　 四、中醫(yī)藥抗病毒性腹瀉有效方藥的篩選和評價
　　 以中國生物醫(yī)學文獻光盤數(shù)據(jù)庫(CBMdisc)和中國學術(shù)期刊全文數(shù)據(jù)庫(CNKI)1

15、999年1月-2008年12月所收集的文獻為資料范圍,以(病毒性腹瀉or秋季腹瀉or急性胃腸炎)and(中醫(yī)or中藥or中成藥or中西醫(yī)結(jié)合or經(jīng)驗報道)為計算機檢索式,從文獻數(shù)據(jù)庫中共檢索到文獻374篇,進一步評定與篩選剔除不合格文獻,最終收集到符合納入和排除標準的合格文獻158篇,每篇文獻中關(guān)于中藥組方的描述均作為一條記錄。
　　 通過對組方的用藥頻次處理,發(fā)現(xiàn)中醫(yī)藥抗病毒性腹瀉的處方用藥主要有如下特點:(1)重視經(jīng)典方劑的

16、運用:明確提到以經(jīng)典方劑(傳統(tǒng)成方)加味治療的文獻47篇,占總數(shù)的34.1％。核心方劑是五苓散、葛根芩連湯、瀉心湯、藿香正氣散、理中湯和七味白術(shù)散。(2)用藥集中:主要集中在云苓、白術(shù)、葛根、藿香、蒼術(shù)、黃芩、車前子等31味核心藥物,占藥物出現(xiàn)總頻次的78.5％。藥物類別主要集中在補虛藥、利水滲濕藥和化濕藥等十大類。(3)健脾滲濕并重:補虛藥用藥頻次最多,且主要集中在健脾益氣藥(白術(shù)、黨參、山藥、扁豆)；利水滲濕藥僅居其次,集中在云苓、

17、車前子、澤瀉、豬苓、薏苡仁?！耙苑綔y證”,可見脾虛濕盛是病毒性腹瀉的主要病機。(4)兼顧病因,加減化裁,忌閉門留寇:除注重健脾滲濕外,化濕藥、清熱藥、消食藥、解表藥、溫里藥比重相對平均,證明致泄病因主要集中在濕、熱、食滯、寒幾類。臨床根據(jù)兼夾不同,可隨證加減,或清化濕熱、或溫化寒濕、或疏表、或消導(dǎo)。收澀藥出現(xiàn)頻次僅居第八位,表明多數(shù)醫(yī)家不主張驟用補澀,以防閉門留寇。
　　 通過對治療病毒性腹瀉有效方藥的篩選和分析,特擬定優(yōu)化組方