諾如病毒熒光定量檢測方法的建立及氯滅活諾如病毒消毒規(guī)律研究.pdf

1、研究目的:
　　諾如病毒(Norovirus,NoV)是一種引起世界范圍內(nèi)非細菌性急性胃腸炎的主要病毒,是杯狀病毒家族的主要成員,能夠引起急性腹瀉、嘔吐的發(fā)生,重者可因脫水死亡或自身免疫缺陷導致嚴重的并發(fā)癥危及生命。從二十世紀九十年代至今,NoVGII.4已經(jīng)逐漸成為了世界范圍內(nèi)的優(yōu)勢流行株,并且造成了至少四次全球性的疾病流行。NoV主要通過糞口途徑傳播,食用被病毒污染的食物、人與人的接觸、食用牡蠣、飲水都可以傳播該病毒,其次通過

2、呼吸道吸入飛揚的嘔吐物微粒也可能是一種傳播途徑。諾如病毒在環(huán)境中高度穩(wěn)定,但是對人卻極易感染,因此也是污染飲用水導致腹瀉疾病流行的重要病因。上個世紀七十年代,通過電鏡發(fā)現(xiàn)了NoV,目前,由于缺乏組織細胞培養(yǎng)系統(tǒng),對于NoV的消毒機理的研究通常采用替代病毒來進行,例如:鼠NoV(murinenorovirus,MNV)、貓杯狀病毒(felinecalicivirus,FeCV)和犬杯狀病毒(caninecalicivirus,CaCV)。

3、因此,調(diào)查研究我國NoV的流行現(xiàn)況,建立快速、準確的檢測方法,為制定相應的控制策略和措施提供依據(jù);對該病毒進行消毒研究,可以更好地提供污水消毒指導方案,進一步保證在污水凈化過程中的細菌學和病毒學安全指標的達成。因此,本課題通過RT-PCR方法研究2009年10～11月天津市兒童醫(yī)院的腹瀉嬰幼兒NoV的流行情況,建立和評價NoV基因II型的熒光定量RT-qPCR檢測方法,采用氯對水中NoV的消毒進行初步研究,為污水中NoV的污染檢測、消毒

4、控制和突發(fā)公共衛(wèi)生事件的快速檢測提供參考方法和依據(jù)。
　　研究方法:
　　收集天津市2009年10～11月兒童醫(yī)院門診部和住院部急性腹瀉患兒糞便標本319例,其中男198例、女121例,最小年齡為出生后兩天,最大為9歲。通過RT-PCR方法確定NoV核酸陽性的標本,將PCR擴增樣本交由公司純化測序,樣本序列結(jié)果經(jīng)過編輯與Genbank中公布的基因進行Blast序列比較,從而判斷樣本的基因型。根據(jù)文獻報道,從Genbank下載

5、NoV各型參考株序列。應用Bioedit軟件進行核苷酸多序列分析比對,利用MEGA4.1軟件鄰位相連法繪制系統(tǒng)發(fā)生樹。采用統(tǒng)計學方法分析樣本的人口學資料和臨床資料。
　　采用RT-PCR檢測NoVGII強陽性的樣本,PCR產(chǎn)物純化后克隆轉(zhuǎn)化,藍白斑陽性克隆篩選,構(gòu)建質(zhì)粒,并轉(zhuǎn)錄合成copyRNA(cRNA)作為標準品,建立和優(yōu)化了NoV基因II型熒光定量RT-qPCR方法和反應體系,制作標準曲線,評價該反應體系的靈敏度、特異性、重

6、復性,并進行臨床糞便樣本的檢測評價。
　　以NoV為研究對象,采用不同濃度的氯(1mg/L、2mg/L、3mg/L、5mg/L、10mg/L)消毒劑處理水中的NoV,使用三對引物對NoV的滅活情況進行評價,其中自行設計分別針對NoV的5’端、3’端的引物,以及ORF1-ORF2結(jié)合區(qū)的引物參照文獻(見第一章)。PH7.2,室溫下,不同時間點取樣,通過RT-PCR探索氯對NoV基因損傷位點,采用熒光定量PCR方法進一步檢測氯消毒過程

7、中NoV的核酸減少量。初步研究氯對NoV的滅活情況。
　　研究結(jié)果:
　　一、2009年10～11月天津市兒童醫(yī)院腹瀉患兒糞便標本中NoV的檢出情況
　　經(jīng)過RT-PCR檢測的319例標本中,共檢出60例NoV陽性。RT-PCR檢測表明,有59例為NoVGII型,有1例為NoVGI型,構(gòu)成比分別為98.3％和1.7%。
　　24例NoV陽性標本PCR產(chǎn)物純化和測序,測序結(jié)果利用bioedit編輯后提交Genban

8、k進行BLAST比對發(fā)現(xiàn),1例是NoVGI型,其余的23例均為NoVGII型。
　　多序列同源性比對發(fā)現(xiàn),測序毒株17株與荷蘭的Nijmegen115參考株、LincolnHouse參考株、Beijing151株和Terneuzen70株序列同源性為71.7～99.3%,與LincolnHouse參考株同源性高達98.0～99.3%。15例GII-4型中13例是2006b變異株;2例是GII-3型。系統(tǒng)發(fā)生樹分析顯示,2009年天

9、津市腹瀉患兒NoV以NoVGII/2006b毒株為主要的流行株,這與我國其他地方目前的研究相似,這表明,目前我國的流行優(yōu)勢株仍然是NoVGII/2006b毒株。
　　不同年齡組NoV陽性的病例分布情況分析表明,60例感染患兒中,0～1歲年齡組的患兒感染NoV35例,1～2歲患兒感染NoV16例,隨著年齡的增大,腹瀉患兒減少,感染NoV的兒童也較少。嬰幼兒NoV的感染主要是集中于0～2歲人群。
　　本研究中門診腹瀉患兒NoV的

10、陽性率是26.75%(41/157),而住院部腹瀉患兒NoV的陽性率是11.11%(18/162),統(tǒng)計學分析二者差別有統(tǒng)計學意義,說明該病發(fā)病急,自限性,恢復快,大多數(shù)病人選擇門診就醫(yī)。
　　二、NoV基因II型熒光定量RT-PCR檢測方法的建立和評估
　　NoVGII熒光定量RT-PCR擴增所使用的引物進行普通RT-PCR反應,2%的瓊脂糖凝膠電泳顯示,在98bp處有特異性條帶,沒有其他非特異性擴增。該引物和探針熒光定量

11、RT-PCR檢測熒光擴增曲線呈典型的光滑的S型曲線。
　　構(gòu)建的質(zhì)粒DNA的純度好,濃度高,經(jīng)過體外轉(zhuǎn)錄純化得到cRNA,cRNA的OD值位于1.7～2.0中間,純度較好,濃度均值為321.83μg/ml。標準曲線的斜率是-3.41,截距是49.79,相關系數(shù)(R2)是0.998。
　　此方法經(jīng)過靈敏度檢測,結(jié)果顯示敏感性好,最低可以檢出102拷貝數(shù)/μl的已知濃度RNA標準品樣本。
　　此方法能夠特異地檢出NoV基因

12、II型,與NoVGI型無交叉反應,與柯薩奇病毒B組、脊髓灰質(zhì)炎病毒、腸道病毒、星狀病毒、甲肝病毒、?？刹《竞洼啝畈《緹o交叉反應。
　　針對標準品的批內(nèi)試驗的Ct值變異系數(shù)(CV)分別為1.60%、0.70%,批間試驗的變異系數(shù)(CV值)分別為0.40%、0.40%,均在5%以下,說明該體系穩(wěn)定,重復性良好。
　　三、氯對水中NoV的消毒研究
　　RT-PCR結(jié)果顯示,NV3R/NV3F引物對擴增條帶最先消失;其次,隨著

13、氯的消毒劑量增大,COG2F/G2-SKR引物對擴增條帶消失;而后,當氯的消毒劑量從5mg/L到10mg/L時,NV5R/NV5F引物對擴增條帶消失。由此,我們認為,在三個不同的擴增中,消毒劑液氯可能優(yōu)先損傷了NoV核酸的3’端,之后是ORF1與ORF2的結(jié)合區(qū),而后損傷了5’端。
　　PH7.2,室溫下,濃度為1mg/L的氯作用下,基于引物COG2F/G2-SKR的熒光定量PCR檢測顯示,NoV的減少率在20min達到2.16l

14、og10。隨著氯濃度的增加,在氯濃度5mg/L的時候NoV的減少率在5min可達到2.24log10,在20min達到3.01log10。
　　結(jié)論:
　　1、2009年10～11月天津市兒童醫(yī)院腹瀉患兒中存在NoV所致的病毒性腹瀉,并且NoV是導致腹瀉的主要病原體;腹瀉患兒存在不同基因型別的NoV感染,NoVGII-4的2006b變異株是主要的流行優(yōu)勢株。
　　2、我們建立和優(yōu)化了熒光定量RT-PCR檢測NoVGII