抗豬腹瀉卵黃抗體添加劑的初步研究.pdf

1、卵黃抗體不僅可以對特定的病原起到很好的防控效果，同時由于卵黃抗體自身含有豐富的營養(yǎng)物質(zhì)可以作為飼料添加劑提高動物的生長性能。因此，通過抗體蛋白飼料添加劑途徑作為一種解決仔豬腹瀉的手段。豬流行性腹瀉（Porc ine epidemic diarrhea, PED）是由豬流行性腹瀉病毒（Porcine epidemic diarrhea virus, PEDV）感染發(fā)病，是仔豬健康的主要威脅，而常規(guī)的疫苗免疫母豬對仔豬的保護效果不佳。因此，

2、研發(fā)抗豬腹瀉的卵黃抗體飼料添加劑便成為新的研究熱點之一。
　　本研究從患有豬流行性腹瀉仔豬腸道組織中擴增 PEDV S基因中含有中和活性的基因表位499～638aa(COE基因)和636～789aa(PEDVS534基因)兩段基因。利用基因重組技術(shù)將COE和PEDVS534兩段基因與pMD18-T連接，進而構(gòu)建原核表達載體，并誘導(dǎo)表達。將原核表達的COE、PEDVS534兩種重組蛋白和豬流行性腹瀉全病毒滅活苗分別用白油佐劑乳化，分

3、別免疫產(chǎn)蛋雞。其中 PEDVS534和COE重組蛋白免疫組的一免劑量均為200μg/只，二免劑量為200μg/只，三免劑量為250μg/只；豬流行性腹瀉全病毒免疫組的一免劑量為0.5 mL，二免劑量為1.0mL，三免劑量為1.5 mL。采用病毒中和試驗檢測卵黃抗體的中和效價。同時利用真核表達技術(shù)將COE基因克隆至畢赤酵母表達載體pPIC9K上，在畢赤酵母中表達。真核表達的COE重組蛋白與弗氏佐劑乳化后免疫小鼠，共免兩次，每次間隔兩周，首

4、免劑量為60μg/只，二免劑量為80μg/只。二免后十天采血進行中和試驗，測定血清的中和效價。結(jié)果顯示，成功克隆了 PEDVS534（534bp）和COE（530bp）基因，原核表達的PEDVS534蛋白和COE蛋白大小分別為37.5kDa和37.0kDa，與理論值相符，且表達的蛋白具有免疫原性。真核表達的COE蛋白大小為27kDa，比理論值偏大，可能是由于蛋白表達時發(fā)生了糖基化反應(yīng)，表達的蛋白免疫小鼠產(chǎn)生的中和抗體效價達到1:36。原

5、核表達的PEDVS534、COE蛋白和 PEDV全病毒作為免疫原制備的卵黃抗體的中和效價分別為1:12、1:25和1:120?？笴OE重組蛋白卵黃抗體臨床試驗結(jié)果顯示卵黃抗體組仔豬死亡率為5.56％，而對照組的死亡率達到61.11%，而試驗組和對照組仔豬的腹瀉率差異不顯著。利用畢赤酵母表達系統(tǒng)表達的COE蛋白具有很好的生物學(xué)活性，能夠誘導(dǎo)機體產(chǎn)生中和抗體；成功制備了三種卵黃抗體，并且三種卵黃抗體均具有一定的中和病毒的能力；抗COE重組蛋