卵黃抗體的制備及其特性研究.pdf

1、本論文對大腸桿菌菌體抗原的制備、雞體免疫、卵黃抗體的制備方法及其特性進(jìn)行了系統(tǒng)研究。該研究為卵黃抗體在疾病治療與控制，免疫學(xué)檢測診斷方面的進(jìn)一步開發(fā)和利用提供了基礎(chǔ)。
　　 試驗以大腸桿菌E.coli為對象，在牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基中活化擴(kuò)培，1.19×109CFU/ml的菌懸液100℃煮沸滅活，與佐劑1:1混合后進(jìn)行免疫。采用雙翅皮下與胸部肌肉四點注射，每只雞1ml，隔10天加強(qiáng)免疫，共免疫4次。卵黃中IgY效價采用間接ELISA

2、方法測定，最高達(dá)1.6×105。
　　 卵黃抗體的提取研究了三種方法。①水稀釋法，卵黃液用水稀釋10倍，用5萬分子截留量的超濾膜超濾濃縮不同倍數(shù)，確定了4～5倍為最適濃縮倍數(shù)，再用45％飽和度的硫酸銨進(jìn)行鹽析。本方法IgY回收率為44.8％，IgY純化倍數(shù)為3.54，每克蛋白中IgY活性為853000。②辛酸法，卵黃液中滴加1％、3％、6％的辛酸，確定最適辛酸濃度為3％，再滴定45％飽和度的硫酸銨沉淀IgY，該方法IgY回收率為

3、60.7％，IgY純化倍數(shù)為2.38，每克蛋白中IgY活性為672000。⑧聚乙二醇法，卵黃液中添加3.5％的PEG6000提取IgY，再向提取液中繼續(xù)添加PEG6000使其終濃度分別為5.5％、6.5％、8.5％、10.5％、12.5％，確定8.5％濃度為最佳濃度。該方法IgY回收率為80.7％，IgY純化倍數(shù)為2.76，每克蛋白中IgY活性為392000。
　　 比較三種提取方法的優(yōu)劣。安全方面，水稀釋法和聚乙二醇法優(yōu)于辛酸

4、法，無污染，不添加任何有毒物質(zhì)。工藝和回收率方面，聚乙二醇法是最好的方法，該法流程最簡單，時間最短，回收率最高。在規(guī)模和純度方面，水稀釋法適合大量生產(chǎn)IgY，獲得的純化倍數(shù)最高。
　　 研究了離子交換色譜和凝膠過濾兩種純化方法。離子交換色譜法摸索了不同pH緩沖液、流速、洗脫方式對分離效果的影響，結(jié)果該法未能將雜蛋白與IgY很好分離。凝膠過濾法研究了樣品處理方式對分離效果的影響，結(jié)果經(jīng)過45％硫酸銨一步鹽析和50％硫酸銨與30％硫

5、酸銨二步鹽析的沉淀樣品，都可在丙烯葡聚糖凝膠柱上實現(xiàn)抗體IgY的有效分離，所得抗體蛋白含量分別為1.069mg/ml、0.609mg/ml，純度分別為92％、98％，效價分別為12800、6400。
　　 卵黃抗體特性的研究?？勾竽c桿菌IgY具有較強(qiáng)的特異性，與大腸桿菌O157:H7、金黃色葡萄球菌(Staphyloccocus aureus)、四聯(lián)球菌(Micrococcus tetragenus)的交叉反應(yīng)小。IgY具有一定