免疫親和柱的制備及其對(duì)酪氨酸酶卵黃抗體的純化.pdf

1、由于傳統(tǒng)方法提取的抗體中特異性抗體含量低，致使其在工業(yè)、商業(yè)以及科研分析檢測(cè)、理論研究和疾病診斷與防治等方面應(yīng)用的局限性。近年來(lái)對(duì)制備IgY的研究進(jìn)展仍停留在一些分離純化方法的優(yōu)化組合，為了高效精準(zhǔn)的提取特異性抗體，同時(shí)也為了進(jìn)一步開發(fā)免疫親和柱提供可靠的數(shù)據(jù)支撐及方法借鑒，建立一套成熟標(biāo)準(zhǔn)的特異性抗體分離純化方法是當(dāng)前迫切需要的。
　　本研究基于以上背景，探究并優(yōu)化了免疫親和柱的制備及使用條件，以高純度酪氨酸酶為抗原免疫蛋雞，分

2、離提取出卵黃抗體，并利用免疫親和柱純化出特異性抗體，最后以效價(jià)結(jié)果和酶活抑制效果綜合判定特異性抗體性能。
　　主要形成以下研究成果:
　　1、研究了配基酪氨酸酶與柱填料的偶聯(lián)條件，通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)確定了三因素三水平的正交試驗(yàn)條件，并由正交試驗(yàn)分析得到最佳偶聯(lián)實(shí)驗(yàn)條件以及最終偶聯(lián)量:偶聯(lián)濃度為20 mg/mL，pH9，溫度為4℃，時(shí)間為12h和17.54 mg。探討了免疫親和柱使用過(guò)程中上樣條件對(duì)最終獲得目的產(chǎn)物的影響，最佳上樣

3、條件為:濃度為0.5 mg/mL，流速為0.5mL/min。探究了免疫親和柱的各方面性能:柱容量為0.2620 mg/mL;重復(fù)使用三次目標(biāo)產(chǎn)物的洗脫率為88.26％，重復(fù)5次使用后洗脫率70％左右;4℃下儲(chǔ)存10天目標(biāo)產(chǎn)物洗脫率仍可達(dá)到88.73％，效果較為理想。
　　2、利用酪氨酸酶作為抗原進(jìn)行免疫注射產(chǎn)生的IgY情況進(jìn)行了探究。結(jié)果表明經(jīng)3次加強(qiáng)免疫注射后，免疫組雞蛋中的卵黃抗體含量基本趨于穩(wěn)定且達(dá)到目標(biāo)理想效價(jià)。提取分離后

4、實(shí)驗(yàn)分析可知，第七周IgY的效價(jià)達(dá)1∶1000左右。對(duì)IgY的熱穩(wěn)定性及酸堿穩(wěn)定性進(jìn)行了探討。實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)，不同的溫度和酸堿度的處理?xiàng)l件下，IgY仍可保持良好的免疫活性。作用溫度區(qū)域?yàn)?5-70℃之間時(shí)，其生物活性及效價(jià)非常穩(wěn)定;在pH4～7的區(qū)域內(nèi)，粗提取IgY效價(jià)一直保持在最高值的50％以上，表現(xiàn)出較高穩(wěn)定性。在粗提取卵黃抗體的酶活抑制實(shí)驗(yàn)中，陰性組和陽(yáng)性組均表現(xiàn)出了部分抑制能力。粗提取陽(yáng)性組平均酶活抑制率為27％以上，粗提取陰性組

5、平均酶活抑制率為16％左右。實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明該粗提取IgY具有部分抑制酪氨酸酶的性能，但效果不突出，作用不穩(wěn)定。
　　3、利用免疫親和層析柱對(duì)粗提取酪氨酸酶IgY進(jìn)行分離提取，收集洗脫峰獲得特異性IgY，回收率為62.91％。該親和層析柱對(duì)分離純化特異性酪氨酸酶IgY具有非常顯著的效果，過(guò)柱經(jīng)免疫親和層析后抗體效價(jià)提高18倍以上。酶活抑制實(shí)驗(yàn)中，相較于粗提取IgY效果，特異性IgY酶活抑制效果持續(xù)且高效，抑制率高達(dá)80％以上;且對(duì)各濃