去氫甲睪酮抗體免疫親和柱的研制及新型載體的開發(fā).pdf

1、去氫甲睪酮(DMT)是一種人工合成的外源蛋白同化激素,能顯著促進(jìn)動(dòng)物肌肉生長(zhǎng),但其在人體內(nèi)積累會(huì)給人體健康造成影響。
　　 目前DMT殘留檢測(cè)主要采用儀器分析的方法,但由于實(shí)際樣品中殘留物濃度低、組分復(fù)雜等因素,在進(jìn)行儀器分析時(shí)常需要對(duì)樣品進(jìn)行凈化處理。與其他樣品前處理技術(shù)相比,免疫親合色譜(IAC)有著特異性強(qiáng)、操作簡(jiǎn)便、重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn),因而被廣泛應(yīng)用于食品中獸藥、農(nóng)藥殘留檢測(cè)。本研究通過將DMT抗體與瓊脂糖或殼聚糖載體偶聯(lián)制

2、備得到了三種DMT免疫親和柱,并對(duì)其性能及樣品凈化處理中可能的應(yīng)用前景進(jìn)行了評(píng)價(jià)。主要結(jié)果如下:
　　 1.免疫得到的DMT抗血清用Hitrap Protein A-Sepharose4B親和層析柱進(jìn)行純化,得到的DMT多克隆抗體與CNBr-Sepharose4B凝膠進(jìn)行偶聯(lián),制各得到DMT多抗免疫親和柱。柱子性能的評(píng)價(jià)方法采用間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA(icELISA)法和HPLC法?？贵w與凝膠偶聯(lián)的最佳時(shí)間為2.5 h,抗體最佳初始

3、濃度為0.5 mg／mL；該免疫親和柱的柱容量約為170 ngDMT／0.1 g干膠；最適洗脫條件為5 mL80％的甲醇.水溶液,柱子平均回收率為97.87％,柱子之間的變異系數(shù)為6.67％；柱子重復(fù)使用3次,回收率仍不低于90％,且和丙酸睪酮(TP)、群勃龍(TB)沒有交叉反應(yīng),特異性良好；在實(shí)際樣品的檢測(cè)中,空白豬肉和飼料樣品中都分別加標(biāo)1.2 ng／g、4.8 ng／g,回收率為74.87％～107.15％,CV小于9.78％；<

4、br>　　 2.雜交瘤細(xì)胞注入BALB／c小鼠腹腔,制備出腹水型單抗,用正辛酸.飽和硫酸銨法純化得到DMT單克隆抗體,將其與CNBr-Sepharose4B偶聯(lián)得到免疫親和柱?？贵w與凝膠偶聯(lián)的最佳時(shí)間3.0 h,抗體最佳初始濃度為0.15 mg／mL；該免疫親和柱的柱容量約為2400 ng DMT／0.1 g干膠；最適洗脫條件為5 mL70％的甲醇.水溶液,柱子平均回收率為88.55％,柱子之間的變異系數(shù)為8.45％；該親和柱能重復(fù)使

5、用3次,且特異性良好；在實(shí)際樣品的檢測(cè)中,空白豬肉和飼料樣品中都分別加標(biāo)1.2 ng／g、4.8 ng／g,回收率為71.11％～100.75％,CV小于8.83％；
　　 3.采用反相懸浮交聯(lián)法制備了交聯(lián)殼聚糖,將DMT單克隆抗體與之偶聯(lián)制備成免疫親和吸附劑,填充入柱即得到免疫親和柱。用紅外光譜對(duì)各階段的反應(yīng)物進(jìn)行結(jié)構(gòu)表征,證明殼聚糖己交聯(lián)且抗體己成功偶聯(lián)。抗體與交聯(lián)殼聚糖最佳的偶聯(lián)條件為pH8.0、時(shí)間8 h、溫度40℃、戊

6、二醛終濃度0.6％；該親和柱最適洗脫條件為3 mL90％的甲醇-水溶液,柱容量約為1800 ng DMT／0.1 g交聯(lián)殼聚糖,柱子平均回收率為92.25％,柱子之間的變異系數(shù)為7.95％；重復(fù)使用次數(shù)為2次；該柱有非特異性吸附,與丙酸睪酮(TP)、群勃龍(TB)的交叉反應(yīng)率分別為24.90％和28.04％,還需對(duì)其結(jié)構(gòu)和交聯(lián)過程進(jìn)行修飾和完善；在實(shí)際樣品的檢測(cè)中,空白豬肉和飼料樣品中都分別加標(biāo)1.2 ng／g、4.8 ng／g,回收率