抗甲型流感病毒多肽化合物的設計、合成、活性與作用機制研究.pdf

1、本文通過以下幾個部分展開論述：
　　第一章以搭“積木”方法設計的低毒性甲型流感病毒進入抑制劑
　　目的:
　　本研究旨在研發(fā)作用于血凝素蛋白的病毒進入抑制劑，并降低藥物的毒性、提高選擇性，使其具有開發(fā)成為抗流感病毒藥物的潛力。以搭“積木”的方法設計一組新型的抗甲型流感病毒復合多肽。這些多肽由兩段多肽片段（積木）組成，分別命名為Jp序列(ARLPR)和Hp序列(KKWK)。將Jp分別連接到Hp的C-末端和N-末端就構成了

2、復合肽庫。復合肽因此具有Cn-Hp-Jp和Cn-Jp-Hp的基本結構，其中n為不同長度的脂肪酸鏈。同時對這些復合肽的抗流感病毒活性、毒性、以及作用機制進行研究。
　　方法:
　　1、通過Fmoc多肽固相合成方法快速、高效地合成了系列多肽，并對多肽的結構進了修飾改造，純化得到最終產(chǎn)物，化合物純度達到或高于90％，可用于后續(xù)的實驗研究。
　　2、采用致細胞病變效應實驗(CPE)對合成修飾后的多肽進行了活性篩選，并對抗病毒活

3、性較好的多肽C20-Jp-Hp進行廣譜的抗流感病毒活性測試，測試病毒株包括甲型流感病毒株A/Puerto Rico/8/34(H1N1)、A/Aichi/2/68(H3N2)、小鼠致病性病毒株A/FM/1/47(H1N1)、NA-H274Y突變病毒株A/Puerto Rico/8/34(H1N1)、臨床分離A型病毒株690（H3亞型）、臨床分離A型病毒株699（H3亞型）、臨床分離B型流感病毒株等。
　　3、通過熒光實時定量PCR

4、、不同加藥模式實驗、空斑實驗、H5N1假病毒實驗、VSVG假病毒實驗、神經(jīng)氨酸酶抑制實驗等方法，探索C20-Jp-Hp的作用靶點。
　　4、探究C20-Jp-Hp作用于HA2亞基融合區(qū)域的研究:利用血凝抑制實驗研究化合物的作用靶點是否在流感病毒包膜表面的血凝素蛋白的HA1亞基上。在溶血實驗中，病毒在酸性條件下能引起病毒與紅細胞膜融合，引起紅細胞溶血反應。加入C20-Jp-Hp測定酸性條件下血紅細胞上清的OD值。為了進一步確證C20

5、-Jp-Hp作用于HA2亞基的融合區(qū)域，進行了圓二色譜實驗和計算機模擬分析。
　　結果:
　　1、在抗流感病毒活性篩選實驗中，我們得到化合物C20-Jp-Hp對流感病毒A/PuertoRico/8/34(H1N1)的IC50值為0.53μM，同時顯示出低毒性和高選擇性的特點。
　　2、在預處理病毒組和同時加藥組的實驗組中，C20-Jp-Hp表現(xiàn)出較好的抗流感病毒活性;初步確定C20-Jp-Hp作用于流感病毒進入宿主細胞

6、的早期階段。同時，通過H5N1假病毒和VSVG假病毒實驗發(fā)現(xiàn)，C20-Jp-Hp對H5N1假病毒有抑制活性，對VSVG假病毒并沒有抑制活性。因此，可能的作用靶點為血凝素蛋白、神經(jīng)氨酸酶蛋白，或者對兩種蛋白均有作用。利用神經(jīng)氨酸酶抑制實驗驗證C20-Jp-Hp是否具有神經(jīng)氨酸酶抑制作用。實驗結果表明，C20-Jp-Hp無抑制神經(jīng)氨酸酶的活性。由此推斷，這類化合物可能的作用靶點在血凝素蛋白HA上。
　　3、C20-Jp-Hp不能抑制病

7、毒引起血凝現(xiàn)象，因此表明C20-Jp-Hp不作用于HA1亞基以阻止病毒吸附宿主細胞。在溶血實驗中，加入C20-Jp-Hp后，發(fā)現(xiàn)該化合物能在酸性條件下抑制病毒的HA蛋白構象變化，抑制溶血反應。所以，C20-Jp-Hp的作用靶點可能在HA蛋白的HA2亞基上，抑制HA蛋白構象的變化。
　　4、圓二色譜實驗和計算機模擬分析。圓二色譜實驗結果發(fā)現(xiàn)C20-Jp-Hp能使來自HA2亞基融合肽部分的HA-FP-O的二級結構發(fā)生變化，因此可以推斷

8、C20-Jp-Hp能與HA2亞基融合肽部分相互作用;計算機模擬也得到相應的結果;由此可知，C20-Jp-Hp能與HA2亞基的融合區(qū)域相結合，從而阻止HA構象的變化。
　　結論:
　　1、通過“積木”拼接的設計方法可以設計出一類新的抗甲型流感病毒的脂肽類化合物。這類化合物不但具有廣譜的抗甲型流感病毒活性，而且具有低毒性和高選擇性的特點，有開發(fā)為新型的抗甲型流感病毒藥物的潛力。
　　2、以C20-Jp-Hp作為先導化合物進

9、行抗甲型流感病毒的機制研究。C20-Jp-Hp在病毒感染宿主的早期階段與HA2亞基中的一段保守的融合肽相互作用，抑制HA2亞基的構象變化，阻止病毒與宿主細胞膜的膜融合。
　　3、流感病毒的融合肽作為HA2亞基中的一段極保守的序列，在病毒包膜與宿主細胞膜融合過程中起著重要的作用，因此是抗病毒藥物有效的作用靶點。
　　第二章以膽甾醇為“特洛伊木馬”的作用于血凝素蛋白保守區(qū)域的甲型流感病毒進入抑制劑
　　目的:
　　基

10、于前一章的研究，對復合肽進行了結構改造，以膽甾醇作為“特洛伊木馬”連接到抗甲型流感病毒的主要作用部分KKWK上，組成新的S-KKWK短脂肽庫。本研究設計、合成獲得了新型的抗甲型流感病毒進入抑制劑S-KKWK，并探究其在HA2亞基上作用的靶點，為抗流感病毒藥物分子的設計提供了指導。
　　方法:
　　1、通過Fmoc多肽固相合成方法快速、高效地合成了系列多肽，并對多肽的結構進了修飾改造，純化得到最終產(chǎn)物，化合物純度達到或高于90

11、％，可用于后續(xù)的實驗研究。
　　2、采用致細胞病變效應實驗(CPE)對合成修飾后的多肽進行了活性篩選，并對抗病毒活性較好的多肽S-KKWK進行廣譜的抗流感病毒活性測試。
　　3、通過熒光實時定量PCR、不同加藥模式實驗、熒光免疫顯微鏡觀察、H5N1假病毒實驗、VSVG假病毒實驗、神經(jīng)氨酸酶抑制實驗等方法，探索S-KKWK的作用靶點。
　　4、對S-KKWK的作用機制和作用位點的研究:利用血凝抑制實驗研究化合物的作用靶點

12、是否為流感病毒包膜表面的血凝素蛋白的HA1亞基;溶血抑制實驗研究S-KKWK的作用靶點是否在HA蛋白的HA2亞基上。為了確證S-KKWK的作用靶點，進行了表面等離子共振(SPR)實驗、圓二色譜實驗和計算機模擬分析。利用SDS-PAGE實驗考馬斯亮藍染色，進一步檢測S-KKWK是否能抑制HA蛋白酶解反應;測定了經(jīng)S-KKWK處理后的病毒溶液的滴度(TCID50)，確定S-KKWK是否具有直接殺滅病毒的效果。
　　結果:
　　1

13、、化合物S-KKWK對流感病毒A/Puerto Rico/8/34(H1N1)的IC50值為1.26±0.15μg/mL，同時對H1N1和H3N2流感病毒都具有抗病毒活性，具有廣譜、高效的抑制流感病毒活性的特點。
　　2、在預處理病毒組和同時加藥組的實驗組中，S-KKWK表現(xiàn)出較好的抗流感病毒活性;初步確定S-KKWK作用于流感病毒進入宿主細胞的早期階段。同時，通過H5N1假病毒和VSVG假病毒實驗發(fā)現(xiàn)，S-KKWK對H5N1假病

14、毒有抑制活性，對VSVG假病毒并沒有抑制活性;因此，可能的作用靶點為血凝素蛋白、神經(jīng)氨酸酶蛋白，或者對兩種蛋白均有作用。利用神經(jīng)氨酸酶抑制實驗驗證S-KKWK是否具有神經(jīng)氨酸酶抑制作用。結果表明，S-KKWK無抑制神經(jīng)氨酸酶的活性。由以上實驗可以推斷，這類化合物可能的作用靶點在血凝素蛋白HA上。
　　3、在SPR實驗中，S-KKWK能與HA蛋白相結合，親和常數(shù)KD值為5.35 nM。因此，S-KKWK是作用于HA蛋白的進入抑制劑。

15、S-KKWK不能抑制病毒引起血凝現(xiàn)象，因此表明S-KKWK不作用于HA1亞基以阻止病毒吸附宿主細胞。在溶血實驗中，加入S-KKWK后，發(fā)現(xiàn)該化合物能在酸性條件下抑制病毒的HA蛋白構象變化，抑制溶血反應。同時，在SPR實驗中發(fā)現(xiàn)S-KKWK能與HA2亞基相結合，親和常數(shù)KD值為16.3 nM。所以，S-KKWK的作用靶點可能在HA蛋白的HA2亞基上，抑制HA蛋白構象的變化，以達到抑制流感病毒的效果。
　　4、經(jīng)圓二色譜實驗和計算機模

16、擬分析發(fā)現(xiàn)，S-KKWK不能使來自HA2亞基融合肽部分的HA-FP-O的二級結構發(fā)生變化。通過計算機模擬得到在HA2亞基的莖部存在一保守的“疏水性口袋”能與SKKWK相互作用。由此可知，S-KKWK能與HA2亞基的一疏水區(qū)域相結合，從而阻止HA構象的變化，阻止病毒進入宿主。
　　結論:
　　1、S-KKWK是對H1N1和H3N2流感病毒都具有抗病毒活性的化合物，且S-KKWK及其衍生物對神經(jīng)氨酸酶抑制劑耐藥的病毒株也有抗病毒

17、活性。據(jù)此推測S-KKWK具有不同于神經(jīng)氨酸酶抑制劑的作用機制。S-KKWK是對流感病毒感染的早期階段有效，能與HA蛋白相互作用，因此屬于病毒進入抑制劑。
　　2、S-KKWK不能作用于HA1的唾液酸結合位點從而抑制病毒吸附宿主細胞，而是作用于HA2亞基莖部的螺旋結構，即通過作用于HA2亞基上一保守的由疏水性氨基酸Val48、Val55(Ile55、H3)、Ile56、Leu99、Val100、Leu108等殘基所組成的“疏水口袋