基于CTL表位流感病毒多肽疫苗分子設(shè)計(jì)、合成、免疫效應(yīng)研究.pdf

1、流感是人類重要的傳染病，全球每年約有20％的兒童和5％的成年人感染，給個(gè)人和社會(huì)帶來(lái)非常大的負(fù)擔(dān)。目前在人群中流行的主要有H1N1、H3N2亞型和乙型流感病毒，而H3N2亞型流感病毒自1968年引起世界流感大流行以來(lái)一直是人群中流行的一個(gè)主要亞型。接種流感疫苗是當(dāng)前預(yù)防流感的主要措施，而目前的流感疫苗主要以流感病毒的膜蛋白血凝素(HA)，神經(jīng)氨酸酶(NA)作為研究對(duì)象，而HA和NA均易發(fā)生變異，從而使流感疫苗的應(yīng)用效果受到一定限制。

2、 細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(cytotoxic T lymphocyte，CTL)介導(dǎo)的特異性細(xì)胞免疫在機(jī)體抗病毒免疫中起著非常重要的作用，其中CTL表位通過(guò)結(jié)合感染細(xì)胞表面的主要組織相容性復(fù)合體(major histocompatibility complex，MHC)類分子，激發(fā)機(jī)體的細(xì)胞免疫水平，有助于病毒的清除與疾病的恢復(fù)，是構(gòu)成防止病毒感染的第二道防線，是目前抗病毒免疫治療的重要研究目標(biāo)。而流感的NP蛋白和M蛋白由于序列高度保守

3、，因此其抗原肽能夠誘導(dǎo)產(chǎn)生針對(duì)同型(A型或B型)和異型病毒株的交叉免疫反應(yīng)，是CTL反應(yīng)的主要靶抗原，探索基于流感病毒NP和M蛋白的CTL表位對(duì)于開(kāi)發(fā)新型疫苗有重要的意義。 傳統(tǒng)的多肽表位篩選和鑒定方法(淋巴細(xì)胞功能試驗(yàn))費(fèi)時(shí)費(fèi)力，通過(guò)生物信息學(xué)技術(shù)預(yù)測(cè)編碼流感病毒的保守區(qū)段的00T細(xì)胞和B細(xì)胞表位，以及主要MHC分子結(jié)合肽，用質(zhì)粒DNA作為載體或者直接合成表位抗原肽，在細(xì)胞因子或其他免疫佐劑的輔助下進(jìn)行免疫，產(chǎn)生強(qiáng)的廣譜的細(xì)胞

4、免疫和體液免疫，由此產(chǎn)生能對(duì)同型病毒的同型保護(hù)和對(duì)異型病毒的交叉保護(hù)作用，有望解決流感病毒的頻繁變異對(duì)于疫苗研制所造成的困難。 【目的】： 1.綜合運(yùn)用多種生物信息學(xué)軟件，發(fā)現(xiàn)流感病毒H3N2內(nèi)部保守蛋白NP蛋白和M蛋白的CTL表位，并提高CTL表位預(yù)測(cè)的準(zhǔn)確率，建立一種新的表位篩選模式。 2.通過(guò)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證前期預(yù)測(cè)的候選表位，發(fā)現(xiàn)新的H3N2內(nèi)部保守蛋白NP蛋白和M蛋白的CTL表位，為開(kāi)發(fā)流感表位疫苗奠定基礎(chǔ)。

5、 【方法】： 1.通過(guò)T細(xì)胞表位預(yù)測(cè)、蛋白酶切位點(diǎn)預(yù)測(cè)、TAP預(yù)測(cè)、分子動(dòng)力模擬對(duì)候選表位肽進(jìn)行篩選，確定所要合成的流感病毒NP、M蛋白表位肽； 2.用芴甲氧羰基固相法合成前期預(yù)測(cè)的多肽，并進(jìn)行親和力、穩(wěn)定性鑒定； 3.采用IFN-γ ELISPOT方法檢測(cè)表位肽的CTL增殖活性，用51Cr釋放實(shí)驗(yàn)分析細(xì)胞毒性分析各實(shí)驗(yàn)肽的CTL殺傷效應(yīng)。 【結(jié)果】 1.生物信息學(xué)的預(yù)測(cè)結(jié)果表明，NP258

6、-266、NP48-56、NP189-197、M58-66、M3-11等5個(gè)表位與HLA-A0201的結(jié)合情況比較理想，選擇進(jìn)入下游實(shí)驗(yàn)； 2.T2結(jié)合實(shí)驗(yàn)顯示：候選肽NP258-266、NP48-56、M58-66的親和力較高，F(xiàn)1值分別是2.06、1.73、1.99，而NP189-197、M3-11親和力較低，F(xiàn)1值分別是0.72、0.23。穩(wěn)定性結(jié)合實(shí)驗(yàn)顯示：表位肽NP258-266、NP48—56、M58-66的半衰期分

7、別為1.96h、2.14h、2.11h，均大于1h，表明穩(wěn)定性較好，選擇進(jìn)入下游實(shí)驗(yàn)： 3.IFN-γ ELISPOT檢測(cè)結(jié)果表明，NP258-266、NP48-56、M58-66每1×105個(gè)誘導(dǎo)的PBMC產(chǎn)生IFN-γ點(diǎn)數(shù)分別為746.3、612.1、665.3，說(shuō)明我們所合成的幾個(gè)表位肽具有較好的免疫原性，51Cr釋放實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示NP258-266、NP48-56、M58-66的特異性殺傷率分別為65.7％、60.4％、5

8、0.3％ 【結(jié)論】 1.采用T細(xì)胞表位預(yù)測(cè)、蛋白酶切位點(diǎn)預(yù)測(cè)、TAP預(yù)測(cè)、分子動(dòng)力模擬構(gòu)成的表位篩選模式對(duì)流感病毒H3N2亞型NP蛋白、M蛋白的HLA—A0201限制性CTL表位進(jìn)行預(yù)測(cè)：從預(yù)測(cè)結(jié)果中選取NP258-266、NP48-56、NP189-197、M58-66、M3-11等四個(gè)表位進(jìn)行合成。 2.T2結(jié)合實(shí)驗(yàn)顯示：候選肽NP258-266、NP48-56、M58-66的F1值均大于1.5，親和力較高；

9、穩(wěn)定性結(jié)合實(shí)驗(yàn)顯示：表位肽NP258-266、NP48-56、M58-66的半衰期分別均大于1h，表明穩(wěn)定性較好。 3.酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)法(ELISPOT法)檢測(cè)和51Cr殺傷實(shí)驗(yàn)檢測(cè)候選肽體外刺激HLA-A0201 陽(yáng)性的健康人PBMC所產(chǎn)生的效應(yīng)細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子和殺傷活性的結(jié)果顯示：NP258-266、NP48-56、M58-66刺激PBMC可以產(chǎn)生較高的T細(xì)胞能特異性的殺傷靶細(xì)胞，并分泌較高水平的IFN-γ。 4.經(jīng)