基于CTL表位流感病毒多肽疫苗分子設計、合成、免疫效應研究.pdf

1、流感是人類重要的傳染病，全球每年約有20％的兒童和5％的成年人感染，給個人和社會帶來非常大的負擔。目前在人群中流行的主要有H1N1、H3N2亞型和乙型流感病毒，而H3N2亞型流感病毒自1968年引起世界流感大流行以來一直是人群中流行的一個主要亞型。接種流感疫苗是當前預防流感的主要措施，而目前的流感疫苗主要以流感病毒的膜蛋白血凝素(HA)，神經氨酸酶(NA)作為研究對象，而HA和NA均易發(fā)生變異，從而使流感疫苗的應用效果受到一定限制。

2、 細胞毒性T淋巴細胞(cytotoxic T lymphocyte，CTL)介導的特異性細胞免疫在機體抗病毒免疫中起著非常重要的作用，其中CTL表位通過結合感染細胞表面的主要組織相容性復合體(major histocompatibility complex，MHC)類分子，激發(fā)機體的細胞免疫水平，有助于病毒的清除與疾病的恢復，是構成防止病毒感染的第二道防線，是目前抗病毒免疫治療的重要研究目標。而流感的NP蛋白和M蛋白由于序列高度保守

3、，因此其抗原肽能夠誘導產生針對同型(A型或B型)和異型病毒株的交叉免疫反應，是CTL反應的主要靶抗原，探索基于流感病毒NP和M蛋白的CTL表位對于開發(fā)新型疫苗有重要的意義。 傳統(tǒng)的多肽表位篩選和鑒定方法(淋巴細胞功能試驗)費時費力，通過生物信息學技術預測編碼流感病毒的保守區(qū)段的00T細胞和B細胞表位，以及主要MHC分子結合肽，用質粒DNA作為載體或者直接合成表位抗原肽，在細胞因子或其他免疫佐劑的輔助下進行免疫，產生強的廣譜的細胞

4、免疫和體液免疫，由此產生能對同型病毒的同型保護和對異型病毒的交叉保護作用，有望解決流感病毒的頻繁變異對于疫苗研制所造成的困難。 【目的】： 1.綜合運用多種生物信息學軟件，發(fā)現(xiàn)流感病毒H3N2內部保守蛋白NP蛋白和M蛋白的CTL表位，并提高CTL表位預測的準確率，建立一種新的表位篩選模式。 2.通過實驗驗證前期預測的候選表位，發(fā)現(xiàn)新的H3N2內部保守蛋白NP蛋白和M蛋白的CTL表位，為開發(fā)流感表位疫苗奠定基礎。

5、 【方法】： 1.通過T細胞表位預測、蛋白酶切位點預測、TAP預測、分子動力模擬對候選表位肽進行篩選，確定所要合成的流感病毒NP、M蛋白表位肽； 2.用芴甲氧羰基固相法合成前期預測的多肽，并進行親和力、穩(wěn)定性鑒定； 3.采用IFN-γ ELISPOT方法檢測表位肽的CTL增殖活性，用51Cr釋放實驗分析細胞毒性分析各實驗肽的CTL殺傷效應。 【結果】 1.生物信息學的預測結果表明，NP258

6、-266、NP48-56、NP189-197、M58-66、M3-11等5個表位與HLA-A0201的結合情況比較理想，選擇進入下游實驗； 2.T2結合實驗顯示：候選肽NP258-266、NP48-56、M58-66的親和力較高，F(xiàn)1值分別是2.06、1.73、1.99，而NP189-197、M3-11親和力較低，F(xiàn)1值分別是0.72、0.23。穩(wěn)定性結合實驗顯示：表位肽NP258-266、NP48—56、M58-66的半衰期分

7、別為1.96h、2.14h、2.11h，均大于1h，表明穩(wěn)定性較好，選擇進入下游實驗： 3.IFN-γ ELISPOT檢測結果表明，NP258-266、NP48-56、M58-66每1×105個誘導的PBMC產生IFN-γ點數分別為746.3、612.1、665.3，說明我們所合成的幾個表位肽具有較好的免疫原性，51Cr釋放實驗結果顯示NP258-266、NP48-56、M58-66的特異性殺傷率分別為65.7％、60.4％、5

8、0.3％ 【結論】 1.采用T細胞表位預測、蛋白酶切位點預測、TAP預測、分子動力模擬構成的表位篩選模式對流感病毒H3N2亞型NP蛋白、M蛋白的HLA—A0201限制性CTL表位進行預測：從預測結果中選取NP258-266、NP48-56、NP189-197、M58-66、M3-11等四個表位進行合成。 2.T2結合實驗顯示：候選肽NP258-266、NP48-56、M58-66的F1值均大于1.5，親和力較高；

9、穩(wěn)定性結合實驗顯示：表位肽NP258-266、NP48-56、M58-66的半衰期分別均大于1h，表明穩(wěn)定性較好。 3.酶聯(lián)免疫斑點法(ELISPOT法)檢測和51Cr殺傷實驗檢測候選肽體外刺激HLA-A0201 陽性的健康人PBMC所產生的效應細胞分泌的細胞因子和殺傷活性的結果顯示：NP258-266、NP48-56、M58-66刺激PBMC可以產生較高的T細胞能特異性的殺傷靶細胞，并分泌較高水平的IFN-γ。 4.經