腸道病毒71型串聯(lián)表位疫苗的分子設(shè)計(jì)與免疫效果評(píng)價(jià).pdf

1、腸道病毒71型(Enterovirus71,EV71)是小RNA病毒科(Picornaviridae)腸道病毒屬的重要成員,主要感染5歲以下兒童,是導(dǎo)致手足口病(Hand-Foot-Mouse)的主要病原體,廣泛流行于亞洲太平洋地區(qū)。該病毒可引起類似于脊髓灰質(zhì)炎的神經(jīng)系統(tǒng)癥狀,是一種重要的新發(fā)嗜神經(jīng)病毒。目前臨床上并無(wú)針對(duì)EV71病毒的有效疫苗和特效藥物,疫苗是控制EV71感染的有效手段,許多疫苗候選株包括甲醛滅活病毒疫苗、減毒活疫苗、

2、病毒樣顆粒疫苗、DNA疫苗以及亞單位疫苗都已取得了很好的實(shí)驗(yàn)結(jié)果,但是缺乏有效的臨床試驗(yàn)數(shù)據(jù)。
　　EV71病毒為單股正鏈RNA病毒,長(zhǎng)度約7500bp,包含單一開放閱讀框(ORF),ORF首先編碼一個(gè)多聚蛋白,然后多聚蛋白被切割成VP1、VP2、VP3和VP4四個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白和若干個(gè)非結(jié)構(gòu)蛋白。在病毒的結(jié)構(gòu)蛋白中,VP1、VP2和VP3暴露于病毒顆粒表面,誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生免疫應(yīng)答,決定了病毒的免疫原性,而VP4則完全位于病毒粒子的內(nèi)部,

3、與病毒的復(fù)制翻譯有關(guān)。目前,許多EV71的線性中和表位已經(jīng)確定,我們利用軟件分析和序列比對(duì)篩選出在EV71不同基因亞型之間具有高度保守性的三個(gè)表位,它們分別是 VP1蛋白上的SP55(氨基酸位置163-177)和SP70(氨基酸位置208-222)以及VP2蛋白上的SP28(氨基酸位置136-150),實(shí)驗(yàn)證明它們均可誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生針對(duì)EV71病毒的特異性中和抗體,是多表位疫苗的理想靶標(biāo)。
　　在本研究中,我們首先構(gòu)建了EV71多個(gè)

4、串聯(lián)線性中和表位(SP55-SP70-SP28)的原核表達(dá)載體,隨后對(duì)其進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá),獲得了 EV71多表位串聯(lián)重組蛋白mTLNE。將純化后的mTLNE免疫小鼠,從體液和細(xì)胞免疫兩個(gè)方面,系統(tǒng)評(píng)價(jià)mTLNE的免疫效果,并進(jìn)一步觀察免疫血清對(duì)小鼠的體內(nèi)保護(hù)效果,明確了mTLNE作為疫苗的可行性。
　　1.EV71串聯(lián)線性中和表位mTLNE的設(shè)計(jì)與構(gòu)建;我們首先對(duì)EV71 B細(xì)胞表位的保守性進(jìn)行分析,選擇SP55、SP70和SP28三

5、個(gè)線性中和表位為靶標(biāo),再基于 EV71國(guó)內(nèi)流行株 AH08/06（GenBank:HQ611148)上三個(gè)線性中和表位的的基因序列以及 pET32a上的限制性酶切位點(diǎn)設(shè)計(jì)引物,為使三個(gè)表位能夠獨(dú)立的展示各自的抗原表位,在各表位之間插入蛋白Linker序列-(G4S)3。
　　為同時(shí)表達(dá)上述三個(gè)表位,我們利用重疊PCR技術(shù)擴(kuò)增三個(gè)串聯(lián)表位的基因序列,然后將該P(yáng)CR產(chǎn)物克隆到pET32a載體中,構(gòu)建包含mTLNE基因的重組質(zhì)粒,最后對(duì)

6、重組質(zhì)粒進(jìn)行核酸序列測(cè)定。結(jié)果表明成功構(gòu)建了包含mTLNE基因的原核表達(dá)載體。
　　2.重組蛋白的表達(dá)、純化和鑒定;將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化BL21感受態(tài)細(xì)胞,用IPTG誘導(dǎo)表達(dá),采用SDS-PAGE的方法進(jìn)行鑒定,結(jié)果顯示:重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化菌經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后在30KD附近出現(xiàn)了一條帶,與預(yù)期大小一致,說明重組質(zhì)?？稍谠思?xì)胞中表達(dá)目的蛋白。隨后又對(duì)誘導(dǎo)菌進(jìn)行超聲破碎處理,同樣采用 SDS-PAGE鑒定,結(jié)果顯示:預(yù)期大小的條帶主要出現(xiàn)在誘導(dǎo)菌

7、的上清中,證明mTLNE為可溶性蛋白。
　　隨后對(duì) mTLNE蛋白進(jìn)行大量表達(dá),用可溶性蛋白試劑盒純化回收,并用SDS-PAGE、Western Blotting、ELISA等方法鑒定純化的蛋白,結(jié)果表明:獲得了mTLNE蛋白,其純度大于99％,并且mTLNE蛋白可與EV71病毒免疫的鼠血清和兔血清反應(yīng),說明重組蛋白mTLNE具有良好的抗原性。
　　3:重組蛋白mTLNE的免疫原性與免疫保護(hù)性分析;將mTLNE蛋白免疫6周齡

8、的BABL/c雌鼠(Trx蛋白為陰性對(duì)照),每隔兩周加強(qiáng)免疫一次,共免疫三次。采用ELISA的方法測(cè)定免疫血清的IgG效價(jià)及亞型,結(jié)果顯示:mTLNE初次免疫后即能夠誘導(dǎo)小鼠體內(nèi)產(chǎn)生EV71病毒特異性的IgG抗體,且隨著免疫的加強(qiáng),IgG效價(jià)逐漸升高,第二次加強(qiáng)免疫之后,IgG效價(jià)可以達(dá)到1:3191,lgG分型顯示mTLNE誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生的lgG亞型主要為IgG1。采用TCID50的方法進(jìn)行中和滴度的測(cè)定,結(jié)果顯示第二次加強(qiáng)免疫后,免疫

9、血清的中和抗體效價(jià)可以達(dá)到1:50。采用ELISPOT的方法對(duì)脾細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果顯示mTLNE免疫小鼠后誘導(dǎo)其體內(nèi)產(chǎn)生的細(xì)胞因子以IL-4和IL-6為主。隨后又測(cè)定了免疫血清對(duì)1日齡BALB/c乳鼠的體內(nèi)保護(hù)效果。結(jié)果顯示:注射mTLNE免疫血清的小鼠全部存活且沒有發(fā)病癥狀,而注射Trx免疫血清和PBS的小鼠在第5天開始發(fā)病,10天之內(nèi)全部死亡,說明mTLNE的免疫血清可以有效的保護(hù)新生乳鼠免受EV71病毒的攻擊。