棉花線粒體耐鹽相關(guān)基因rps12、ccmC、nad3的克隆及其表達分析.pdf

1、棉花是一種耐鹽性較強的作物，在鹽堿地的開發(fā)利用方面具有重要價值。研究棉花的耐鹽性，發(fā)掘優(yōu)異耐鹽基因，提高耐鹽水平，顯得尤為重要。植物的耐鹽性與線粒體有著重要聯(lián)系，本研究在0.4％的鹽量脅迫法處理下，通過實時熒光定量PCR從陸地棉中9409篩選到三個耐鹽相關(guān)的線粒體基因rps12、ccmC、nad3;克隆并對其進行了生物信息學(xué)分析;利用熒光表達載體分析其亞細胞定位;構(gòu)建了過表達載體，花序侵染法轉(zhuǎn)化擬南芥和基因槍活體轉(zhuǎn)化方法轉(zhuǎn)化棉花用來驗證

2、其功能。主要研究結(jié)果如下:
　　1實時熒光定量PCR分析結(jié)果表明，鹽脅迫后rps12、ccmC、nad3基因的相對表達量均是先升高，至6h時表達量最高，之后又逐漸降低，表明三個基因受到鹽脅迫的誘導(dǎo)表達;發(fā)現(xiàn)rps12、ccmC、nad3基因在棉花根、莖、葉和花中均有表達，但是不同基因稍有差別，其中ccmC基因在根中的表達量最高，在莖和葉中的表達量較少;而rps12基因、nad3基因均是在葉和花中的表達量較高，在根中的表達量最少，說

3、明三個基因在棉花中具有組織表達差異性。
　　2基因rps12的ORF全長為372 bp，編碼123個氨基酸，蛋白分子量約為14.102kD，等電點為11.11; ccmC基因的ORF全長為753 bp，編碼250個氨基酸，蛋白分子量約為27.756 kD，等電點約為9.66;基因nad3的ORF全長為357 bp，編碼118個氨基酸，蛋白分子量約為13.675kD，等電點約為4.58;三個蛋白由α螺旋、延伸鏈、β-轉(zhuǎn)角和無規(guī)則卷曲

4、組成，均不存在信號肽;進化樹分析表明，均與種子植物中的蛋白親緣關(guān)系更近。
　　3構(gòu)建了原核表達載體pET28a-rps12，以大腸桿菌BL21(DE3)為表達菌株，經(jīng)過IPTG誘導(dǎo)，pET28a-rps12在大腸桿菌BL21中表達出了16.397kD的融合蛋白。
　　4成功構(gòu)建了熒光表達載體pBI121-rps12∷GFP、pBI121-ccmC∷GFP、pBI121-nad3∷GFP，利用基因槍轉(zhuǎn)化技術(shù)轉(zhuǎn)入洋蔥內(nèi)表皮細胞，

5、激光共聚焦顯微鏡觀察，發(fā)現(xiàn)ccmC蛋白定位在細胞核以及細胞質(zhì)中，rps12蛋白和nad3蛋白定位在細胞膜和核膜。
　　5構(gòu)建了過表達載體pBI121-rps12、pBI121-ccmC、pBI121-nad3，利用花序侵染法轉(zhuǎn)入擬南芥，分子檢測表明得到了轉(zhuǎn)基因擬南芥，通過種子發(fā)芽和成株期耐鹽性實驗，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因擬南芥的耐鹽性高于野生型擬南芥，這些基因可能在植物耐鹽過程中發(fā)揮一定的作用;利用基因槍活體轉(zhuǎn)化技術(shù)轉(zhuǎn)化棉花，對棉花耐鹽新種質(zhì)