釀酒酵母三個耐鹽相關基因克隆及其在棉花中轉化.pdf

1、鹽漬化是限制植物生長和農作物產(chǎn)量的一個重要因素。棉花是鹽堿地的先鋒作物，是開發(fā)利用鹽漬化土地的理想作物之一。通過基因工程和轉基因技術提高棉花耐鹽性已經(jīng)成為當前棉花育種的一個迫切需求和重要方向。
　　相關研究表明，釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)基因組中與耐鹽相關的基因有200多個。其中，ENA1(exitu natru1)基因編碼一種P型鹽誘導的ATPase，具有外排Na+、Li+的功能；轉化擬南芥后，

2、轉基因擬南芥在酸堿條件下的耐鹽性均有所提高。HAL1(halotolerance1)基因是ENA1基因的效應子，通過提高反饋調節(jié)中K+吸收的量來促進K+的吸收；ScHAL1基因轉化植物后不僅可以提高轉基因植株的耐鹽性，而且提高其耐堿性和作物產(chǎn)量。釀酒酵母YCF1(yeast cadmium factor1)蛋白是液泡膜上S-谷胱甘肽結合轉運蛋白，依賴于Mg-ATP，在重金屬Cd+、Hg2+的轉運解毒中起作用；轉ScYCF1基因擬南芥在較

3、高鹽脅迫下比野生型對NaCl的耐受性強。
　　本研究以釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)As2.375為實驗材料，通過NCBI數(shù)據(jù)庫得到釀酒酵母耐鹽相關基因ENA1、HAL1和YCF1的mRNA序列，利用RT-PCR技術克隆了三個基因。其中ENA1(GenBank: NM_001180348.1)基因全長3276bp，編碼1091個氨基酸；HAL1(GenBank: EF015596.1)基因全長885b

4、p，編碼294個氨基酸；YCF1(GenBank: NM_001180442.3)基因全長4548bp，編碼1515個氨基酸。對三個基因編碼的蛋白進行生物信息學分析發(fā)現(xiàn)，三個蛋白的等電點分別為5.53、9.01和8.64， ENA1蛋白呈酸性且?guī)ж撾?，HAL1和YCF1蛋白帶正電荷呈堿性；親疏水性分析結果表明，ENA1和HAL1蛋白表現(xiàn)為親水性，而YCF1蛋白則是疏水性蛋白。同時，三個蛋白二級結構中都含有α螺旋、β-折疊片、β-轉角和無

5、規(guī)則卷曲。
　　構建綠色熒光融合表達載體 pBI121-ENA1::GFP、pBI121-HAL1::GFP和pBI121-YCF1::GFP，對三個基因進行洋蔥內表皮亞細胞定位發(fā)現(xiàn)ENA1蛋白和YCF1蛋白在細胞膜上表達，而HAL1基因編碼的蛋白則定位于表皮細胞的細胞質中。棉花花粉的瞬時表達分析中，基因槍轟擊后花粉的綠色熒光都明顯增強，證明三個基因在棉花花粉中表達，為下一步使用基因槍活體轉化技術獲得轉基因耐鹽材料奠定基礎。

6、>　　利用基因槍技術將三個基因分別活體轉化陸地棉(Gossypium hirsutumL.)材料中棉所12，并對收獲的T1代轉基因種子進行耐鹽性篩選和分子檢測。0.6％ NaCl鹽溶液脅迫下，轉釀酒酵母ENA1、HAL1和YCF1基因的轉基因種子的發(fā)芽率和根生長情況均優(yōu)于對照中棉所12自交種，證明三個基因轉化棉花后均可以明顯提高種子耐鹽性。對T1代轉基因種子進行分子檢測，以載體質粒為陽性對照，中棉所12自交種DNA為陰性對照，用所設計的