利用VIGS技術(shù)研究棉花三個(gè)鋅指蛋白基因的耐逆性.pdf

1、棉花作為一種主要的經(jīng)濟(jì)作物，與國(guó)計(jì)民生密切相關(guān)，在農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)發(fā)展中處于重要地位。我國(guó)棉花生產(chǎn)位居世界前列，同時(shí)也是最大的棉花消耗國(guó)。隨著環(huán)境不斷惡化，干旱、鹽堿、極端溫度等各種非生物逆境危害嚴(yán)重制約著棉花產(chǎn)量和品質(zhì)的提高;全球可耕土地減少，而且近年來(lái)，國(guó)家調(diào)整種植業(yè)產(chǎn)業(yè)結(jié)構(gòu)，棉花種植面積逐年減少。棉花是耐逆性較強(qiáng)的作物，因此進(jìn)一步提高棉花耐逆能力，是提高土地利用率，保證棉花產(chǎn)量的重要措施。
　　鋅指蛋白(zinc finger pr

2、otein)是一類(lèi)和鋅離子結(jié)合后能折疊成手指狀結(jié)構(gòu)域的轉(zhuǎn)錄因子，在動(dòng)植物和微生物中廣泛存在。這類(lèi)蛋白通過(guò)與DNA、RNA結(jié)合或與其他蛋白質(zhì)的相互作用來(lái)調(diào)控下游基因的表達(dá)，其作用貫穿于生命活動(dòng)的各個(gè)過(guò)程。鋅指蛋白在植物體內(nèi)發(fā)揮著重要的作用，可以調(diào)節(jié)生長(zhǎng)發(fā)育、增強(qiáng)耐病耐逆性等。
　　病毒誘導(dǎo)的基因沉默(VIGS)技術(shù)是指在病毒載體中插入一段目的基因序列，利用重組載體侵染宿主植物，使宿主目的基因發(fā)生沉默繼而引起表型變化，通過(guò)表型變異進(jìn)行

3、基因功能分析。該技術(shù)可以快速、高效分析植物基因功能。
　　本實(shí)驗(yàn)室前期通過(guò)同源克隆方法得到了三個(gè)鋅指蛋白基因GhZFP2，GhRCHY1，GhBBX1，通過(guò)qRT-PCR對(duì)這三個(gè)基因進(jìn)行了逆境誘導(dǎo)表達(dá)分析，轉(zhuǎn)煙草結(jié)果表明在煙草中異源表達(dá)這三個(gè)基因可以提高煙草的耐鹽和耐旱性。本研究基于前期研究結(jié)果，進(jìn)一步構(gòu)建了三個(gè)基因的VIGS載體，利用注射的方法將病毒轉(zhuǎn)入棉花后進(jìn)行鹽脅迫和干旱脅迫處理，通過(guò)測(cè)定相關(guān)生理指標(biāo)進(jìn)一步來(lái)研究這三個(gè)基因的

4、功能，同時(shí)也構(gòu)建了與棉花抗逆相關(guān)基因的VIGS快速功能驗(yàn)證體系。主要結(jié)果如下:
　　1、通過(guò)不同濃度的NaC1和PEG6000處理兩葉一心期的晉棉19幼苗，獲得最佳NaCl處理濃度為200 mM，最佳PEG6000處理濃度為15％(w/v)。將目的基因片段構(gòu)建到pTRV2載體上，得到了pTRV2-GhZFP2、pTRV2-GhRCHY1、pTRV2-GhBBX1重組載體，將其轉(zhuǎn)入棉花。通過(guò)qRT-PCR和RT-PCR檢測(cè)目的基因沉

5、默情況，獲得目的基因表達(dá)量明顯下降的基因沉默植株。
　　2、對(duì)沉默植株進(jìn)行鹽脅迫處理，檢測(cè)葉片凈光合速率，Pro含量，SOD活性，MDA含量，K+/Na+等5個(gè)耐鹽相關(guān)指標(biāo)。結(jié)果表明:在鹽脅迫下，沉默GhZFP2、GhRCHY1、GhBBX1這三個(gè)基因的植株，葉片凈光合速率顯著低于Mock組，其中pTRV2-GhZFP2、pTRV2-GhRCHY1達(dá)到了極顯著水平;所有沉默植株的Pro含量變化倍數(shù)均比Mock組低，其中pTRV2-

6、GhBBX1組達(dá)到了顯著水平;所有沉默植株的SOD活性變化倍數(shù)極顯著地低于Mock組;所有沉默植株的MDA含量變化倍數(shù)高于Mock組，但沒(méi)有達(dá)到顯著水平;所有沉默植株地上部分的K+/Na+顯著低于Mock組，其中 pTRV2-GhBBX1組達(dá)到了極顯著差異，pTRV2-GhRCHY1、pTRV2-GhBBX1組地下部K+/Na+顯著地低于Mock組。結(jié)果表明:在鹽脅迫下，基因沉默植株凈光合速率比Mock組低;滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)積累速率也比Mo

7、ck組低;清除活性氧的酶活變化比Mock組低，同時(shí)質(zhì)膜氧化產(chǎn)物積累速率比Mock組高;地上部和地下部吸收和積累更多的Na+，使植株體內(nèi)離子平衡受到破壞。
　　3、對(duì)沉默植株進(jìn)行干旱脅迫處理，檢測(cè)葉片凈光合速率，葉片失水率，氣孔孔徑，Pro含量，SOD活性，MDA含量等6個(gè)耐旱相關(guān)指標(biāo)。耐旱相關(guān)指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果表明:在干旱脅迫下，沉默GhZFP2、GhRCHY1、GhBBX1這三個(gè)基因的植株葉片凈光合速率低于Mock組，其中pTRV2-

8、GhZFP2、pTRV2-GhRCHY1達(dá)到了顯著水平;所有沉默植株的葉片失水率都比Mock組高;干旱脅迫10d、20d后，所有沉默植株的氣孔孔徑都比Mock組小，且達(dá)到了極顯著差異;所有沉默植株的Pro含量變化倍數(shù)均比Mock組低，其中pTRV2-GhZFP2、pTRV2-GhRCHY1組達(dá)到了顯著水平;所有沉默植株的SOD活性變化倍數(shù)顯著地低于Mock組;所有沉默植株的MDA含量變化倍數(shù)高于Mock組，其中pTRV2-GhBBX1組

9、達(dá)到了顯著差異。結(jié)果表明:在干旱脅迫下，基因沉默植株凈光合速率比Mock組低，影響植株的光合作用;葉片失水率比Mock組高同時(shí)氣孔孔徑比Mock組變小，植株水分散失較多;滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)積累速率也比Mock組低，滲透調(diào)節(jié)能力降低;清除活性氧的酶活變化比Mock組低，同時(shí)質(zhì)膜氧化產(chǎn)物積累速率比Mock組高，破壞了質(zhì)膜的完整性和穩(wěn)定性。
　　研究表明這三個(gè)基因都參與棉花對(duì)鹽脅迫和干旱脅迫的響應(yīng)，目前這三個(gè)基因的轉(zhuǎn)基因棉花材料創(chuàng)制工作正在進(jìn)