快速研究棉花基因功能的VIGS技術平臺的初步構建.pdf

1、棉花是世界上最重要的經濟作物之一，其生長周期比較長，適宜不同地區(qū)和國家栽培，品種差異很大。棉花植株棉酚類物質含量比較豐富，離體培養(yǎng)的組織或器官很容易被氧化，組織培養(yǎng)和離體操作比較困難，效率比較低。主要栽培的陸地棉和海島棉是異源四倍體，基因組比較大，生長周期長，造成棉花基因功能研究的過程工作量大，且基于轉基因技術進行功能分析比較困難。此前棉花基因功能研究和分子生物學研究還不是很成熟，而且棉花的EST數(shù)據(jù)庫信息缺乏，極大限制了棉花分子生物學

2、的發(fā)展；但隨著野生棉雷蒙德氏棉 D基因組和栽培棉亞洲棉 A基因組測序完成，棉花數(shù)據(jù)庫得到了很大的擴展。給后續(xù)的棉花分子生物學研究奠定了穩(wěn)固的基礎，所以快速高效進行棉花基因功能研究的方法是十分必要的。
　　在過去的植物基因功能研究中，創(chuàng)建突變體和轉基因技術是有效的基因功能研究方法。但是對棉花來說，生長周期長和獲得穩(wěn)定的突變體比較困難，所以一種快速高效地進行棉花基因組功能研究方法始終是追尋的目標。VIGS（virus-induced

3、genesilence）是一種利用修飾過的病毒作為載體，整合內源目的基因轉化進入受體能引起轉錄后目的基因沉默的技術。在本研究中大規(guī)模轉基因研究表明，VIGS是一種效率高、速度快、操作簡便、可信度大、能夠進行棉花從營養(yǎng)器官到生殖器官高效快速分析基因功能的實用技術。
　　本論文主要以修飾過的雙生病毒載體pCLCrVA和pCLCrVB來研究棉花內源基因GhACNAT的生物學功能為主要研究內容。經生物信息學分析，GhACNAT屬于酰基轉移

4、酶(EC2.3.1.)家族基因，該酶家族主要催化?；霓D移，參與脂質的合成與代謝。通過注射的方式將構建好的VIGS-GhACNAT系統(tǒng)轉化進入陸地棉 C312幼苗子葉中，檢測為陽性的植株進行深層次地探究，主要從GhACNAT-silence植株性狀，相關基因表達分析，內源基因互作和代謝通路等方面進行分析。GhACNAT-silence植株營養(yǎng)器官生長無明顯異常，而生殖器官出現(xiàn)了花粉囊不開裂、花絲變短、柱頭開裂扭曲、部分花粉失活、棉鈴大小

5、形態(tài)異常等表型。GhACNAT-silence植株與陰性對照株CK（轉入pCLCrV-空載）生殖器官基因表達差異經cDNA-AFLP技術分析得出，其中脂質，糖類和氨基酸的代謝過程關鍵酶基因表達顯著改變，GhACNAT-silence植株中脂質的合成與代謝和茉莉酸合成相關的一些基因表達水平發(fā)生了顯著的降低，經GC-MS測定的茉莉酸含量及其顯著降低。驗證試驗中經外源 MeJA（茉莉酸甲酯）處理，GhACNAT-silence植株中花粉囊不開