利用條件基因打靶技術研究新型鋅指蛋白ZBTB20對軟骨發(fā)育的調(diào)控作用.pdf

1、鋅指蛋白在個體的生長發(fā)育、細胞的增殖和分化、凋亡等生命活動過程中發(fā)揮重要作用。鋅指蛋白ZBTB20是從人樹突狀細胞中發(fā)現(xiàn)的BTB/POZ鋅指蛋白家族新成員，廣泛表達于腦、脾臟、胰腺和肝臟等正常組織，但其生物學功能尚不清楚。本課題組利用基因打靶技術，成功建立了ZBTB20全身性基因敲除小鼠模型，發(fā)現(xiàn)其存在生長發(fā)育遲緩等嚴重表型，提示ZBTB20對個體生長發(fā)育具有重要調(diào)節(jié)作用，其機理有待深入研究。為此，本課題首先制備了ZBTB20的單克隆抗

2、體，建立了檢測人和鼠ZBTB20蛋白敏感度高、特異性強和穩(wěn)定性好的檢測分析方法。采用多肽抗原免疫和骨髓瘤細胞融合技術，通過四輪亞克隆篩選，最終得到一株穩(wěn)定分泌ZBTB20單克隆抗體的雜交瘤細胞株；通過制備雜交瘤腹水、親和層析柱純化，成功制備了可用于ELISA、免疫組化、免疫印跡和免疫沉淀檢測的抗ZBTB2單克隆抗體，命名為9A10。和已有的ZBTB20多克隆抗體相比，該單抗具有更高的檢測靈敏度、特異性和穩(wěn)定性，為深入研究ZBTB20的體

3、內(nèi)生物學功能提供了技術支持。利用該單克隆抗體，我們優(yōu)化了免疫組化檢測方法，并用此方法檢測了ZBTB20在多種組織器官中的表達，發(fā)現(xiàn)ZBTB20在小鼠軟骨細胞中特異性高表達，提示ZBTB20可能在軟骨發(fā)育中起到調(diào)控作用：進一步通過定點交配取得野生型小鼠胚胎期及出生后各發(fā)育階段腿骨標本并制樣，對軟骨細胞中ZBTB20的時空表達特征進行了系統(tǒng)分析。結(jié)果表明，ZBTB20于胚胎軟骨發(fā)育的E14.5天開始表達，并特異表達于軟骨生長板的肥大區(qū)。為研