KRAB鋅指蛋白ZNF331基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控研究.pdf

1、第一部分：鋅指蛋白ZNF463基因是該研究室新近克隆的精子發(fā)生相關(guān)基因。該基因是鋅指蛋白基因ZNF331的一種剪接體。為了進(jìn)一步研究KRAB鋅指蛋白ZNF463基因表達(dá)的亞細(xì)胞定位，用RT-PCR法從正常人睪丸組織中擴(kuò)增得到人ZNF463基因的翻譯區(qū)全長cDNA，并定向克隆到真核表達(dá)載體pEGFP-C1質(zhì)粒中，構(gòu)建了ZNF463-GFP融合基因表達(dá)載體。然后以脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)入Cos-7細(xì)胞中，熒光顯微鏡觀察顯示：在轉(zhuǎn)染重組真核表達(dá)載體pE

2、GFP-ZNF463的Cos-7細(xì)胞中，熒光主要集中在細(xì)胞核內(nèi)，而在轉(zhuǎn)染空白載體pEGF-Cl的細(xì)胞中，熒光布滿整個(gè)細(xì)胞。本實(shí)驗(yàn)表明轉(zhuǎn)染的Cos-7細(xì)胞能表達(dá)人ZNF463蛋白，該蛋白定位于細(xì)胞核內(nèi)，與其所屬家族成員作為轉(zhuǎn)錄因子發(fā)揮作用的特征相符。 第二部分：ZNF33l基因是與甲狀腺腫瘤發(fā)生密切相關(guān)的KRAB鋅指蛋白基因。其異常表達(dá)可能是甲狀腺腫瘤發(fā)生的分子機(jī)制之一。迄今尚未見有關(guān)該基因在轉(zhuǎn)錄水平調(diào)節(jié)的報(bào)道。為了從轉(zhuǎn)錄水平了解其調(diào)控

3、機(jī)制，首先取其5端啟動(dòng)子區(qū)域l.31kb片段及其8個(gè)不同長度的缺失體連接到含有螢火蟲熒光素酶基因但無啟動(dòng)子的pGL3-basic載體中。經(jīng)轉(zhuǎn)染HEK293H細(xì)胞發(fā)現(xiàn)，含有1.31kb片段的重組體表現(xiàn)出明顯的啟動(dòng)子活性，與含有SV40啟動(dòng)子的陽性對(duì)照質(zhì)粒pGL3-control相當(dāng)。正向漸進(jìn)性缺失分析發(fā)現(xiàn)其5'端-198bp到＋44bp間長為242bp的區(qū)域包含能啟動(dòng)基礎(chǔ)水平轉(zhuǎn)錄的核心啟動(dòng)子區(qū)，經(jīng)TRANSFAc數(shù)據(jù)庫分析該區(qū)域存在一個(gè)C

4、AAT盒、變異的TATA盒和GC盒。從-806bp到-512bp之間的缺失和從-370bp到-198bp之間的缺失使活性降低了2.8倍，從-1258bp到-806bp之間的缺失使活性升高1.6倍，提示這些缺失片段可能含有重要的正性或負(fù)性調(diào)控元件。為了進(jìn)一步明確核心啟動(dòng)子序列及基礎(chǔ)轉(zhuǎn)錄所需的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，該研究進(jìn)行了反向缺失分析，并同時(shí)考察5'端非翻譯區(qū)是否對(duì)啟動(dòng)子活性產(chǎn)生影響，從-198位點(diǎn)依次向3'端擴(kuò)增不同長度的另外6個(gè)片段，按前述

5、正向缺失分析法構(gòu)建與pGL3-basic的重組體并轉(zhuǎn)染細(xì)胞，活性測(cè)定結(jié)果將包含核心啟動(dòng)子的最小片段縮小到-198bp～-16bp區(qū)域，否定了可能發(fā)揮基礎(chǔ)轉(zhuǎn)錄作用的TATA盒的存在，結(jié)果也反映了cDNA非翻譯區(qū)的確對(duì)啟動(dòng)子活性存在影響。與此同時(shí)該研究采用定點(diǎn)突變技術(shù)否定了有功能的CAAT盒存在的可能性，采用對(duì)SPl有特殊抑制效應(yīng)的藥物處理方法證實(shí)了SPl因子結(jié)合位點(diǎn)存在的可能性。本實(shí)驗(yàn)為進(jìn)一步闡明ZNF331基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制提供了基礎(chǔ)。