人類靈長類特異鋅指蛋白ZNF480在肌生成中的作用.pdf

1、靈長類特異的KRAB鋅指基因約占人類基因組KRAB鋅指基因的30％。目前國際上有關(guān)靈長類特異鋅指基因的功能知之甚少。我們選擇鋅指基因ZNF480為模型研究靈長類特異鋅指蛋白的功能。
　　 ZNF480基因在肌肉和心臟組織中高表達(dá),提示該基因可能與肌肉和心臟組織的發(fā)育有關(guān)。半定量RT-PCR和western blot實(shí)驗(yàn)證明,在誘導(dǎo)的C2C12穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞的肌分化過程中,ZNF480的mRNA和蛋白質(zhì)水平持續(xù)上調(diào),說明ZNF480

2、與肌分化過程密切相關(guān)。
　　 為了從形態(tài)上檢測ZNF480是否調(diào)控肌生成的過程,我們通過形態(tài)學(xué)和肌肉分化特異性抗體MHC對誘導(dǎo)分化的穩(wěn)定系細(xì)胞進(jìn)行免疫熒光檢測。與載體過表達(dá)對照組比較,過表達(dá)ZNF480促進(jìn)C2C12細(xì)胞形成更多的肌管和多核細(xì)胞,并且ZNF480穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞的肌管和多核細(xì)胞隨著分化過程的進(jìn)行而逐步增多。
　　 Myf-5,myogenin,MyoD是bHLH生肌調(diào)節(jié)因子,而E47,E12則是普遍表達(dá)的bHLH

3、蛋白。在肌分化過程中,MyoD和Myf5表達(dá)是決定多能性體節(jié)細(xì)胞定型為成肌細(xì)胞的關(guān)鍵步驟,myogenin在成肌細(xì)胞的終極分化中有重要作用。我們檢測了ZNF480是否對這些基因進(jìn)行調(diào)控。半定量RT-PCR和western blot實(shí)驗(yàn)證明,ZNF480能上調(diào)肌肉特異性bHLH轉(zhuǎn)錄因子和肌肉特異性基因MCK(肌肉激酶)的mRNA水平,以及MHC和myogenin的蛋白水平,說明ZNF480是通過調(diào)控bHZH和MCK促進(jìn)肌分化。同時,ZNF

4、480過表達(dá)的C2C12穩(wěn)定系分化過程中,p21的蛋白水平明顯上調(diào),說明ZNF480通過激活p21使細(xì)胞退出細(xì)胞周期而進(jìn)入細(xì)胞分化。
　　 利用熒光素酶活性實(shí)驗(yàn),我們檢測到ZNF480在NIH3T3細(xì)胞中并不能促進(jìn)E12或MyoD對MCK啟動子(MCK4800和4RTK)活性的調(diào)節(jié),但ZNF480能與E12/MyoD共轉(zhuǎn)時增強(qiáng)MCK啟動子的活性,說明ZNF480是通過與E12/MyoD協(xié)同調(diào)節(jié)MCK啟動子的活性。
　　

5、為了進(jìn)一步檢測ZNF480是否結(jié)合到MCK和myogenin的啟動子上對其進(jìn)行轉(zhuǎn)錄調(diào)控,我們利用EMSA實(shí)驗(yàn),證明了ZNF480不能直接結(jié)合到MCK啟動子上,但是能夠與E12/MyoD形成蛋白復(fù)合體結(jié)合到MCK的啟動子區(qū)域。同時,EMSA實(shí)驗(yàn)證明ZNF480能夠直接結(jié)合到myogenin的啟動子區(qū)域。這些結(jié)果表明ZNF480通過形成蛋白復(fù)合體或直接結(jié)合的方式來調(diào)節(jié)MCK和myogenin的啟動子活性,從而參與肌肉分化的調(diào)控過程。