三種鋅指蛋白在NDV、AIV感染中作用的初探.pdf

1、先天性抗病毒因子在機體抗病毒感染的免疫應答過程中起著重要作用，是當前抗病毒免疫研究的熱點問題。研究表明，鋅指蛋白也是一種先天性抗病毒因子，在機體的免疫系統(tǒng)扮演著重要角色。鋅指蛋白可以調節(jié)細胞因子如白細胞介素、干擾素的表達，并直接調控淋巴細胞的生長和分化。在先天免疫應答過程中，鋅指蛋白直接或間接發(fā)揮抗病毒作用。盡管如此，在禽類上鋅指蛋白的研究幾乎是一片空白，對其結構和功能一無所知。如果能通過研究禽鋅指蛋白的功能，篩選到一些在抗感染免疫中發(fā)

2、揮重要功能的鋅指蛋白，將可能為新藥的開發(fā)或禽類疫病的防控提供新的思路，因此我們開展了以下幾方面內容的研究。
　　1)新城疫病毒感染對多種雞源鋅指蛋白表達的影響
　　在前期研究中，本實驗室通過高通量測序獲得了NDV感染CEF細胞后鋅指蛋白的表達譜。在此基礎上，本研究篩選了10種在病毒感染后表達量發(fā)生明顯變化的鋅指蛋白進行后續(xù)研究。依據(jù)GenBank預測的鋅指蛋白基因序列，首先初步設計了檢測鋅指蛋白mRNA水平的RT-qPCR引

3、物，對NDV感染DF-1細胞中10種鋅指蛋白表達量的變化情況進行檢測。結果顯示，chZC3 HAV1、chZC3H6和chZEB1三種鋅指蛋白在病毒感染后表達下調，在后期又明顯的上調，說明這三種鋅指蛋白可能參與了病毒感染過程。隨后，我們從CEF細胞的cDNA樣品中擴增出上述三種鋅指蛋白的完整基因序列并進行生物信息學分析。雞的chZC3HAV1、chZC3H6與其他禽類的同源基因親源性較近，其次是爬行動物，而與哺乳動物親源性最低，而雞的c

4、hZEB1蛋白在進化上與其他禽類哺乳動物、爬行動物的親源性都很高，這說明ZEB1在進化上非常保守。結構域預測結果顯示雞源ZC3HAV1、ZC3H6和ZEB1蛋白具有和人源蛋白類似的功能結構域，其鋅指結構在進化上是相對保守的，推測雞源和人源鋅指蛋白具有相似的功能。
　　2)雞鋅指蛋白chZC3HAV1、chZC3H6和chZEB1的抗病毒功能的初步鑒定
　　為了確認chZC3HAV1、chZC3H6和chZEB1是否參與病毒感

5、染后宿主細胞的抗感染免疫應答過程，本研究對上述三種鋅指蛋白的抗病毒功能進行了初步鑒定。首先，通過已經獲得的chZC3HAV1、chZC3H6和chZEB1基因序列對qPCR檢測引物和體系進行優(yōu)化，最終獲得了靈敏性高、特異性好、分別針對三種鋅指蛋白的RT-qPCR檢測方法。在對多種細胞和雞組織臟器中的鋅指蛋白進行定量檢測，發(fā)現(xiàn)三種鋅指蛋白廣泛表達于雞的組織細胞中，脾臟和法氏囊中的表達量都相對較高。病毒感染試驗結果顯示，在NDV感染中后期，

6、chZC3HAV1、chZEB1表達量大幅上升;AIV感染能強有力刺激chZC3HAV1的上調表達。過表達chZEB1實驗結果表明，chZEB1不能抑制NDV的增殖，說明chZEB1可能并不直接參與抗感染的免疫應答，有可能是參與特異性免疫應答過程中。過表達chZC3HAV1發(fā)現(xiàn)，chZC3HAV1對NDV的增殖抑制能力不強，卻能夠有限抑制AIV的增殖。
　　3) chZC3HAV1抑制病毒增殖的機制研究
　　本研究對chZC

7、3HAV1抗病毒功能做了更進一步的研究。首先，通過過表達chZC3HAV1，我們發(fā)現(xiàn)chZC3HAV1具有很強的抗AIV作用而對NDV抗病毒能力較弱。通過比較AIV和NDV感染后細胞不同時間點中chZC3HAV1的表達，我們發(fā)現(xiàn)NDV不能在感染早期誘導chZC3HAV1的基因上調，而整個AIV感染過程中，chZC3HAV1表達量一直上調。后續(xù)體內實驗證實了這一現(xiàn)象，NDV感染早期，雞組織臟器中的chZC3HAV1表達量并未出現(xiàn)明顯上調。

8、由于chZC3HAV1是一種早期抗病毒因子，推測NDV感染后chZC3HAV1表達的滯后是其不能有效發(fā)揮抗NDV作用的因素之一。本研究進一步研究了chZC3HAV1的抗病毒機制。通過雙熒光素酶檢測系統(tǒng)，我們發(fā)現(xiàn)過表達chZC3HAV1不能激活NF-κB、IRF-3/7、IFN-β等信號通路，間接證明chZC3HAV1并不能和人源ZC3HAV1基因一樣，通過與RIG-Ⅰ的相互作用增強干擾素信號，這表明雞天然缺失RIG-Ⅰ造成了部分先天性免