AIV,NDV,IBV和ILTV液相檢測芯片方法的建立.pdf

1、隨著養(yǎng)禽業(yè)集約化程度的提高，禽呼吸系統(tǒng)病毒性疾病的發(fā)病率逐漸上升，而且由單一病原感染向多種病原混合感染發(fā)展，臨床上難以鑒別診斷，往往延誤防治時機，給養(yǎng)禽業(yè)帶來巨大的經(jīng)濟損失。禽流感病毒（Avian influenza virus，AIV）、新城疫病毒(Newcastle disease virus，NDV)、雞傳染性喉氣管炎病毒(Infectious Laryngotracheitisvirus，ILTV)、傳染性支氣管炎病毒（Infe

2、ctious bronchitis virus，IBV）是引起禽類呼吸系統(tǒng)疾病的重要病毒性病原，臨床發(fā)病率高，難以鑒別診斷，因此建立一種既快速又準確的檢測方法，成為國內(nèi)外獸醫(yī)工作者研究的方向。液相芯片技術(shù)作為一種新型的高通量檢測技術(shù)，具有操作簡便、準確性高、高通量檢測等常規(guī)方法無法比擬的優(yōu)點，適合對多種病原的快速檢測。本試驗即從單重液相芯片和多重液相芯片兩方面研究檢測AIV H5、H7、H9三種亞型，NDV、IBV、ILTV6種病毒核酸

3、的液相芯片方法，旨在為禽類呼吸系統(tǒng)病毒性疾病病原的快速而準確的檢測奠定基礎(chǔ)。
　　 從GenBank中收集AIV的H5、H7、H9毒株的HA基因序列，NDV的F基因序列，IBV的N基因序列和ILTV的TK基因序列，分別用DNA MAN、DNA star、Primer5.0和Primer Express3.0等生物軟件進行多序列比對分析，篩選出保守區(qū)，設(shè)計各個病毒的引物和探針。將設(shè)計好的探針引物進行標記后與熒光編碼微球偶聯(lián)。將不對

4、稱PCR/RT-PCR擴增好的PCR產(chǎn)物與偶聯(lián)有微球的探針雜交，應(yīng)用Bio-Plex200系統(tǒng)分析讀取MFI值，根據(jù)判定標準進行判定，并進行了特異性、敏感性、穩(wěn)定性試驗以及臨床樣品的檢測。
　　 通過對雜交溫度、雜交時間等反應(yīng)條件的優(yōu)化首先建立了AIV H5、H7、H9亞型，NDV、IBV、ILTV6種病毒核酸單重液相芯片的檢測方法。結(jié)果表明，AIV H5、H7、H9亞型，NDV、IBV、ILTV6種病毒核酸的最低檢測濃度分別為

5、8.50×10-4ng/μL、2.87×10-4ng/μL、2.07×10-4ng/μL、2.61×10-4ng/μL、2.34×103ng/μL、2.05×10-3ng/μL,與相應(yīng)病毒RT-PCR/PCR檢測方法相比，敏感性提高10-100倍;每種芯片得到的MFI值都較高，且只能特異的檢測出各自的病毒核酸，而對其它病毒的檢測結(jié)果均為陰性;對臨床50份已知樣品檢測的結(jié)果，相符率為100％。結(jié)果表明，本實驗所建立的檢測AIV的H5、H7

6、、H9三個亞型、NDV、IBV、ILTV6種病毒核酸的單重液相芯片技術(shù)敏感性、特異性和穩(wěn)定性均較好。
　　 在此基礎(chǔ)建立了同時檢測AIV H5、H7、H9、NDV、IBV、ILTV6種病毒核酸的多重液相芯片檢測方法。多重液相芯片的檢測方法中各個病毒探針對相應(yīng)病毒核酸檢測的MFI值較高，與其他病毒之間沒有交叉反應(yīng)，重復性好;每種病原核酸的最低檢測濃度分別為5.44×10-4ng/μL、1.84×10-3ng/μL、2.65×10-

7、4ng/μL、8.35×10-3ng/μLng/ul、1.50×10-3ng/μL、6.56×10-3ng/μL，靈敏度比相應(yīng)PCR/RT-PCR方法提高了5-125倍。應(yīng)用建立的液相芯片體系對50份已知病毒樣品進行檢測，結(jié)果符合率為100％。
　　 本試驗成功地建立了檢測AIV H5、H7、H9、NDV、IBV和ILTV6種病毒核酸的單重液相芯片和多重液相芯片的方法，為禽呼吸系統(tǒng)病毒性疾病的快速、高通量鑒別診斷搭建了新的技術(shù)平