腹瀉病毒化學(xué)發(fā)光基因芯片檢測方法的建立和驗(yàn)證.pdf

1、目的：腹瀉病是常見病、多發(fā)病，全球每年死于腹瀉相關(guān)疾病或其并發(fā)癥的兒童達(dá)上百萬。腹瀉病毒的感染是腹瀉病的主要病因，而導(dǎo)致病毒性腹瀉的病毒主要有札如病毒、A組輪狀病毒、B組輪狀病毒、星狀病毒、I型諾如病毒、Ⅱ型諾如病毒、腸道腺病毒。腹瀉病毒具有潛伏期短、傳染性強(qiáng)、易爆發(fā)等特點(diǎn)，而且目前尚無特效的藥物對抗腹瀉病毒，因此快速準(zhǔn)確地檢測病毒在腹瀉病的治療和預(yù)防上顯得尤為重要。目前腹瀉病毒的檢測方法主要有電鏡法、免疫學(xué)檢測、PCR法等，但這些方法

2、均無法達(dá)到高通量的檢測。本文旨在建立一種7種腹瀉病毒化學(xué)發(fā)光基因芯片檢測方法，該芯片能夠同時(shí)檢測7種腹瀉病毒，大大縮短了檢測時(shí)間，增加了檢測通量，提高了檢測效率，為腹瀉病毒的檢測提供一種新的高通量檢測手段。
　　方法：1、調(diào)研文獻(xiàn)確定本研究擬檢測的病原體及病原體靶基因。2、收集病原體樣本，對無臨床樣本的 B組輪狀病毒，通過人工合成其靶基因。3、利用Clustalx1.8.msw Alignmen、Primer5.0等生物學(xué)軟件設(shè)計(jì)

3、引物與探針，并合成、篩選特異的引物與探針。4、優(yōu)化多重RT-PCR體系。5、制備質(zhì)粒參考品、體外轉(zhuǎn)錄RNA參考品，在優(yōu)化好的多重RT-PCR體系和芯片雜交條件下，評價(jià)芯片的特異性、靈敏度、重復(fù)性，檢測100例臨床樣本，評價(jià)芯片的實(shí)用性。
　　結(jié)果：1、調(diào)研文獻(xiàn)確定擬檢測的7種腹瀉病毒，札如病毒、A組輪狀病毒、B組輪狀病毒、I型諾如病毒、Ⅱ型諾如病毒、星狀病毒、腸道腺病毒及其靶基因。2、共篩選出7對特異性引物和12條特異性探針。3、

4、完成7種腹瀉病毒質(zhì)粒參考品的構(gòu)建，并以質(zhì)粒參考品為模板，構(gòu)建了7種腹瀉病毒體外轉(zhuǎn)錄RNA參考品。4、為了保證每個(gè)靶基因在多重RT-PCR體系中的擴(kuò)增效率，針對體系引物組合、引物濃度配比等條件對多重RT-PCR體系進(jìn)行了優(yōu)化。最終分為A、B兩組多重RT-PCR體系，建立了腹瀉病毒化學(xué)發(fā)光基因芯片檢測方法。5、為驗(yàn)證方法的可靠性，以制備好的體外轉(zhuǎn)錄RNA參考品為模板，在優(yōu)化好的RT-PCR體系和芯片雜交條件下對該芯片的特異性、靈敏度和重復(fù)性

5、進(jìn)行考核。結(jié)果顯示，該芯片檢測體外轉(zhuǎn)錄RNA參考品的靈敏度為3.0×103copies/μl；特異性良好，無交叉現(xiàn)象，能很好的區(qū)分上述7種腹瀉病毒。檢測100例臨床樣本的靈敏度為95.2％、特異性為92.1%、符合率為95.1%。
　　結(jié)論：本文建立了一種腹瀉病毒化學(xué)發(fā)光基因芯片檢測方法，利用該方法能夠同時(shí)檢測7種腹瀉病毒。芯片性能考核結(jié)果顯示，該芯片的特異性、靈敏度和重復(fù)性均達(dá)到預(yù)期的性能要求。該方法的建立為腹瀉病毒的臨床診斷和