液相阻斷elisa檢測方法

1、一、亞洲一、亞洲I型口蹄疫抗體液相阻斷型口蹄疫抗體液相阻斷ELISAELISA試驗操作方法試驗操作方法一、試驗一、試驗器材準(zhǔn)備器材準(zhǔn)備1.移液器:550l移液器、0.2—10l移液器、50—200l移液器、50—300l12道移液器各一把。2.移液槍尖(若干)。3.抗原抗體反應(yīng)板:微量血凝板(U型、V型均可)5塊本試劑盒配備兩塊用于被檢血清的稀釋和抗原抗體反應(yīng)。注:抗原抗體反應(yīng)板可重復(fù)使用實驗后用水沖洗干凈然后用無離子水沸水浴30秒晾干

2、待用。4.超純水無離子水或蒸餾水。二、二、試劑準(zhǔn)備試劑準(zhǔn)備1.包被緩沖液(PH9.6)將所購試劑盒配備的碳酸鹽緩沖液膠囊1粒小心打開將膠囊內(nèi)粉末倒入100ml無離子水中溶解即可。4℃存放1月內(nèi)有效。2.洗滌液(PBST)將試劑盒配備的25倍濃縮PBST液(可能有結(jié)晶形成用時微熱溶化)用無離子水或蒸餾水做1:25稀釋。(如果如果PHPH降低降低務(wù)必用務(wù)必用NaOHNaOH調(diào)至調(diào)至7.4)7.4)3.底物溶液取1片檸檬酸—磷酸鹽片劑(試劑盒

3、配備)溶于100mL無離子水中溶化后取50mL溶液再加1片鄰苯二胺(OPD)片劑充分溶解分裝（5mL瓶或10Ml∕瓶)避光之2O℃保存。用前避光溶化臨時每1mL上述溶液加10L本試劑盒配備的3%的雙氧水(H202)。三、三、操作步驟操作步驟1.用包被緩沖液稀釋亞洲1型口蹄疫病毒兔抗血清至工作濃(1:1000)在ELISA板上每孔加50l振蕩封板或置濕盒內(nèi)，室溫過夜。圖19696孔酶標(biāo)板檢測孔酶標(biāo)板檢測1010份樣品布局圖份樣品布局圖S1

4、1:8S2S3S4S5S6S7S8S9S101:321:41:161：641:81:321：1281:641：256血清至工作濃度(1:1000)每孔加50l封板37℃溫育1小時。5.同上洗板5次甩干。用lPBST稀釋兔抗豚鼠酶結(jié)合物至工作濃度(1:500)每孔加50l封板37℃溫育1小時。6.同上洗板5次每孔加50l底物溶液(務(wù)必加雙氧水)37℃溫育15分鐘。每孔再加50l終止液終止反應(yīng)立即在492nm波長下讀取光吸收值(OD492n

5、m值)。四、四、結(jié)果判定結(jié)果判定1.試驗認(rèn)可標(biāo)準(zhǔn)每塊板設(shè)4孔病毒抗原對照病毒抗原對照不加任何血清直接用PBST稀釋至使用濃度與血清病毒抗原復(fù)合物同步加入ELISA板孔50l孔病毒抗原對照OD492nm值應(yīng)在1.50.5范圍內(nèi)。陽性對照抗體效價應(yīng)在1:10241滴度以內(nèi)陰性對照血清抗體效價應(yīng)＜1:8。2.病毒抗原對照平均OD492nm值50%計算(臨界值)抗原對照是4孔棄去最高和最低OD492nm值計算剩余2孔的平均OD492nm值再除以

6、2即50%對照值。該值即為臨界值，表示阻斷50%反應(yīng)的對照OD492nm值。3.結(jié)果判定以病毒抗原對照平均OD492nm值的50%為臨界值被檢血清稀釋孔OD492nm值大于臨界值的孔為陰性孔小于或等于臨界值的孔為陽性孔陽性孔的OD492nm值等于臨界值時所對應(yīng)的稀釋度為該份血清的抗體滴度。例如病毒抗原對照平均OD492nm值為1.2則其50%為0.60。若某一待檢血清在1:128時OD492nm值為0.6則該份待檢血清的抗體滴度為1:1