基于RABV糖蛋白膜外區(qū)的阻斷ELISA抗體檢測方法建立及應(yīng)用.pdf

1、狂犬?。≧abies）是由狂犬病病毒（Rabies virus，RABV）引起的一種具有極高致死性的人獸共患傳染病，能夠感染人和溫血動物。全球每年因該病死亡的人數(shù)在60000人左右。目前該病尚無有效的治療方法，感染人一旦出現(xiàn)癥狀，病死率100％。但只要進行有效的暴露后處置，就可100%預(yù)防本病的發(fā)生。由于犬是本病的重要貯存和傳播宿主，針對犬進行免疫可有效預(yù)防本病的發(fā)生，防止其向人群的傳播。業(yè)已證明，70%的犬只免疫覆蓋率即可有效阻止狂犬

2、病的傳播。
　　評價免疫效果及免疫覆蓋率的指標(biāo)是機體內(nèi)RABV中和抗體的水平。目前針對狂犬病中和抗體測定的方法有多種，國際上認可的金標(biāo)準(zhǔn)方法包括動物體內(nèi)中和試驗和細胞中和試驗。由于動物中和試驗常采用較多動物，花費周期較長，目前已不多用。細胞中和試驗方法有熒光抗體病毒中和試驗（Fluorescent antibodyvirus neutralization，F(xiàn)AVN）和快速熒光灶抑制試驗（Rapid fluorescent focu

3、s inhibition test，RFFIT）兩種。但這兩種方法通常需要在2~3個工作日才能完成，并涉及活毒操作，需要專業(yè)培訓(xùn)的技術(shù)人員，比較適合專業(yè)化的實驗室使用。由于條件限制，在我國省級以下的基層實驗室尚未使用以上兩種試驗方法開展RABV中和抗體的檢測，而是大多采用 ELISA的方法，進行抗體檢測和免疫覆蓋率監(jiān)測。目前國內(nèi)外報道的ELIS A方法包括間接ELISA、競爭ELISA和阻斷ELISA等，這些方法大多采用純化的或部分純化

4、的RABV作為包被抗原。由于犬血清成分復(fù)雜，假陽性或假陰性結(jié)果在這些方法中較為常見。降低假陽性和假陰性背景是目前RABV抗體檢測ELISA方法中亟待克服的問題。
　　糖蛋白（glycoprotein，GP）是狂犬病病毒的5種結(jié)構(gòu)蛋白之一，是RABV的關(guān)鍵蛋白。其能夠影響病毒的毒力，刺激機體產(chǎn)生保護性病毒中和抗體（vira l neutralizing antibody，VNA），誘發(fā)機體產(chǎn)生免疫保護反應(yīng)。因此糖蛋白是檢測狂犬病抗體

5、的理想抗原。但該蛋白是一種跨膜蛋白，較難從完整病毒中獲得，在重組表達中對表達體系糖基化能力的要求較高。成熟的G蛋白由三個結(jié)構(gòu)域構(gòu)成：膜外區(qū)（ectodomain，ED）、穿膜區(qū)（transmembrane，TM）和細胞質(zhì)區(qū)（cytoplasmic domain，CD），其中膜外區(qū)是中和抗原表位所在部位。因此，本研究采用哺乳動物表達系統(tǒng)，分泌表達糖蛋白的膜外區(qū)部分，并基于此表達產(chǎn)物和本實驗室具有的、針對該糖蛋白的中和性單克隆抗體，建立了不

6、依賴于全病毒顆粒作為包被抗原的狂犬病阻斷ELISA抗體檢測方法，試圖降低假陽性和假陰性背景，為狂犬病提供一種可靠的、可供大規(guī)模樣品免疫監(jiān)測的手段?，F(xiàn)將方法和結(jié)果報告如下：
　　1.穩(wěn)定表達狂犬病病毒糖蛋白膜外區(qū)的細胞系的構(gòu)建：首先獲得BD06株RABV的G蛋白膜外區(qū)基因片段，與載體pCMV-Sec酶切連接，構(gòu)建重組質(zhì)粒；測定HEK293細胞對篩選藥物博來霉素（zeocin）的敏感性；將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293細胞，利用篩選藥物加壓得到陽

7、性克??；分別利用ELISA和Western Blot方法對陽性克隆表達上清的反應(yīng)原性進行鑒定；同時，對得到的細胞系連續(xù)傳代并凍存復(fù)蘇，檢測細胞系的表達穩(wěn)定性。結(jié)果顯示，該部分研究成功擴增得到G蛋白膜外區(qū)片段G-e1317，并將該片段成功插入表達載體pCMV-Sec，得到重組質(zhì)粒pCMV-Ge；確定了700μg/ml的zeocin濃度為轉(zhuǎn)染后的最佳藥物篩選濃度；重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細胞后，得到8個有zeoc in抗性的細胞克隆，通過 ELISA檢

8、測得到5株能夠與RABV糖蛋白單抗6F12以及his標(biāo)簽單抗發(fā)生反應(yīng)的細胞株；分別使用RABV糖蛋白單抗和his單抗進行WB，均在60kd左右得到與預(yù)期相符的目的條帶；細胞系連續(xù)傳至60代次后表達水平無明顯變化，凍存和復(fù)蘇對細胞系的表達水平也無明顯影響，證實篩選得到的細胞系較為穩(wěn)定。
　　2.RABV阻斷ELISA抗體檢測體系的建立：利用細胞系表達的RABV G蛋白作為抗原，建立阻斷ELISA抗體檢測方法，并分別對ELISA體系的

9、各步條件進行優(yōu)化，包括：抗原包被液的選擇、抗原包被時間和溫度條件、封閉液的選擇、抗原包被濃度與單抗稀釋倍數(shù)的確定、酶標(biāo)抗體的選擇、血清反應(yīng)條件的優(yōu)化、洗液的選擇、顯色條件的優(yōu)化以及抗原包被穩(wěn)定劑的選用等。條件優(yōu)化后，檢測25份陰性血清，根據(jù)公式：檢測臨界PI值=陰性血清PI平均值+2×SD得到該方法的檢測臨界值；通過對多個血清的重復(fù)檢測（批間和批內(nèi)），對方法的重復(fù)性進行評價。最終，此部分研究成功確定優(yōu)化后的ELISA反應(yīng)體系：37℃表達

10、上清原液包被1.5h，0.05%的P BST洗滌3次后，使用20%的陰性血清于37℃封閉2h；洗滌后，加入待檢血清原液，于37℃反應(yīng)45 min；洗滌后，加入1:500倍稀釋的6F12酶標(biāo)抗體，37℃孵育1h；洗去抗體后，加入TM B顯色液，于37℃條件下避光顯色7 min，終止顯色，讀取數(shù)值。加速試驗的結(jié)果證明，經(jīng)穩(wěn)定劑處理的ELISA板在37℃保存14天后，對于不同效價血清的檢測結(jié)果與當(dāng)天包被板的檢測結(jié)果無顯著差異（P＜0.05），

11、證明穩(wěn)定劑對包被抗原有較好的保護效果；同時，根據(jù)陰性血清的 PI值檢測結(jié)果及臨界值計算公式，得到32.1%作為臨界PI值；重復(fù)性評價結(jié)果顯示，不同效價的血清樣品在批間和批內(nèi)檢測中OD值的變異系數(shù)（CV）均在10%以下，證實該方法有較好的重復(fù)性。
　　3.RABV阻斷 ELISA抗體檢測方法的應(yīng)用：分別利用FAVN和優(yōu)化后的ELISA方法對364份犬血清臨床樣品進行檢測，以FAVN為金標(biāo)準(zhǔn)，根據(jù)結(jié)果繪制ROC曲線，得到AUC值，計算

12、在32.1%臨界值下檢測的敏感性和特異性，以及ELISA方法檢測結(jié)果與金標(biāo)方法的符合率。同時，利用Yo ude n指數(shù)評價得到較優(yōu)臨界值。結(jié)果顯示，對364份血清樣品的檢測中，以FAVN為金標(biāo)準(zhǔn)，ELISA方法的檢測敏感性為88.9%，特異性為98.6%，與FAVN檢測的符合率為92.6%。ROC分析得到的曲線下面積為0.964，證實該方法有很高的診斷價值。同時，根據(jù)Yo uden指數(shù)評價結(jié)果也顯示，32.1%為較優(yōu)臨界值，為ELISA

13、試劑盒產(chǎn)品的開發(fā)奠定基礎(chǔ)。
　　通過以上研究，得出以下結(jié)論：
　　1.本研究成功構(gòu)建了能夠穩(wěn)定表達狂犬病病毒糖蛋白膜外區(qū)的細胞系，并通過ELISA和WB證實蛋白的反應(yīng)原性，為G蛋白膜外區(qū)的應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。
　　2.利用細胞系表達產(chǎn)物和單抗建立了檢測血清狂犬抗體的阻斷ELISA方法，并實現(xiàn)了對該方法的優(yōu)化，確立了阻斷 ELIS A最佳反應(yīng)條件：表達上清原液在37℃條件下包被1.5h；使用20%的陰性血清作為封閉液在37℃

14、封閉2 h；待檢血清以原液加入，于37℃反應(yīng)45min；之后加入1:500倍稀釋的6F12酶標(biāo)抗體，37℃孵育1h；以上各步之間均使用0.05%的PBS T洗滌3次，最后洗去抗體后，加入TMB顯色液，于37℃條件下避光顯色7min；終止顯色后，讀取數(shù)值。
　　3.通過對226份陽性犬臨床血清樣品和138份陰性臨床樣品的檢測，證實該方法與FAVN金標(biāo)準(zhǔn)有較高的符合率（92.6%），為試劑盒產(chǎn)品的開發(fā)提供重要數(shù)據(jù)。
　　通過以上

15、研究可以看出本研究的創(chuàng)新點包括：
　　1.首次利用哺乳動物細胞表達系統(tǒng)實現(xiàn)對RABV糖蛋白膜外區(qū)的分泌表達，并通過培養(yǎng)條件摸索，采用其無血清細胞培養(yǎng)基中的表達產(chǎn)物直接應(yīng)用于阻斷ELISA方法中的抗原包被，節(jié)省了抗原純化成本。由于采用了RABV單一成分G蛋白作為包被抗原，減少了病毒顆粒中其他成分的反應(yīng)背景。
　　2.在國內(nèi)首次采用糖蛋白的膜外區(qū)作為抗原建立了RABV阻斷ELISA抗體檢測方法，并驗證了其與金標(biāo)方法的一致性，已在