肌肉特異性蛋白MG53在骨髓肌缺血缺氧損傷中的作用機(jī)制.pdf

1、目的
　　急性肢體缺血是血管外科最常見(jiàn)的疾病之一，其致殘率和死亡率高，主要原因是由于手術(shù)中長(zhǎng)時(shí)間的動(dòng)脈夾閉、急性動(dòng)脈血栓形成、動(dòng)脈栓塞、創(chuàng)傷及血管損傷等，該病起病急劇，疼痛劇烈，且多在活動(dòng)中突然發(fā)生，一旦肢體供血的主動(dòng)脈突然中斷，使遠(yuǎn)端肢體處于缺血缺氧狀態(tài)，如持續(xù)發(fā)展會(huì)導(dǎo)致組織細(xì)胞功能失調(diào)甚至死亡。因此，早期明確診斷和治療對(duì)于血管外科醫(yī)生是一個(gè)極大的挑戰(zhàn)。最近研究發(fā)現(xiàn)，肌肉特異性蛋白MG53在骨骼肌細(xì)胞膜的修復(fù)過(guò)程中起重要作用，并

2、發(fā)現(xiàn)其對(duì)心肌細(xì)胞的急性缺氧、氧化應(yīng)激及缺血再灌注損傷起到保護(hù)作用，但MG53在骨骼肌缺血缺氧損傷中的相關(guān)研究現(xiàn)尚未見(jiàn)報(bào)道。因此，本課題推測(cè)MG53能夠在急性肢體缺血過(guò)程中對(duì)骨骼肌起到一定的保護(hù)作用。本研究主要探索MG53是否能夠?qū)毙灾w缺血過(guò)程中骨骼肌的損傷起到修復(fù)和保護(hù)作用以及相關(guān)作用機(jī)制。
　　實(shí)驗(yàn)材料與方法
　　1、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及主要試劑
　　200～250g雄性SD(Sprague-Dawley)大鼠及2～3天新

3、生雌雄不限SD大鼠購(gòu)買(mǎi)于中國(guó)醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心;CoC(l)2、MTT、二甲基亞砜購(gòu)買(mǎi)于sigma公司;DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、胰蛋白酶購(gòu)買(mǎi)于HyClone公司;HIF-1α、MG53、BAX、Bcl-2、p27、GAPDH蛋白抗體購(gòu)買(mǎi)于SantaCruz公司，流式細(xì)胞凋亡和增殖檢測(cè)試劑盒購(gòu)買(mǎi)于BD公司。
　　2、動(dòng)物模型
　　200～250g雄性SD大鼠共30只，分為5組（每組6只），包括對(duì)照組(0h)6只，實(shí)驗(yàn)組根據(jù)

4、不同的結(jié)扎時(shí)間分為4h、8h、12h和24h。所有大鼠經(jīng)10％水合氯醛腹腔麻醉，實(shí)驗(yàn)組使用7-0血管線結(jié)扎左側(cè)髂內(nèi)、外動(dòng)脈和股動(dòng)脈，對(duì)照組僅暴露左側(cè)髂內(nèi)外動(dòng)脈及股動(dòng)脈而不結(jié)扎。不同時(shí)間點(diǎn)處死后切取肌肉標(biāo)本，4％多聚甲醛固定或液氮中凍存。
　　3、蘇木精和伊紅染色
　　骨骼肌組織福爾馬林固定，二甲苯酒精脫水，石蠟包埋切片。嚴(yán)格按照標(biāo)準(zhǔn)蘇木精和伊紅染色步驟，在普通光學(xué)顯微鏡(TE2000-S，Nikon,Japan)下觀察結(jié)果。

5、
　　4、透射電子顯微鏡觀察
　　骨骼肌組織經(jīng)2.5％戊二醛固定，四氧化鋨固定及環(huán)氧樹(shù)脂包埋，再經(jīng)半薄切片，用1％甲苯胺藍(lán)染色，在光鏡下觀察，并對(duì)合適的區(qū)域進(jìn)行修整，超薄切片經(jīng)乙酸雙氧鈾和檸檬酸鉛染色，在透射顯微鏡JEM-1200EX(Jeol，Tokyo，Japan)下觀察結(jié)果。
　　5、乳酸脫氫酶及肌酸激酶檢測(cè)
　　采集大鼠血樣并收集在富含EDTA的離心管中，離心取上清置-70℃冷凍儲(chǔ)存，所有樣本均經(jīng)全自動(dòng)分

6、析儀(Au2700，Olympus，Japan)檢測(cè)。
　　6、細(xì)胞培養(yǎng)
　　大鼠骨骼肌來(lái)自于2～3天新生SD大鼠的四肢。貼壁法培養(yǎng)原代大鼠骨骼肌細(xì)胞，細(xì)胞被傳代3～6次，置于37℃，5％CO2的培養(yǎng)箱中，應(yīng)用含10％血清的高糖DMEM培養(yǎng)。
　　7、免疫熒光染色
　　骨骼肌細(xì)胞以104密度生長(zhǎng)于24孔板或玻片上，PBS洗滌3次，用多聚甲醛固定，5％BSA室溫封閉2小時(shí)，一抗4℃孵育過(guò)夜，熒光標(biāo)記二抗室溫孵育2小

7、時(shí)，Hoechst33258染核。在倒置熒光顯微鏡或激光共聚焦顯微成像下觀察染色情況(FV1000S-SIM/IX81,Olympus,Japan)。
　　8、免疫印跡
　　骨骼肌組織標(biāo)本或細(xì)胞置于EP管中，加入適量蛋白裂解液及蛋白酶抑制劑(PMSF)，勻漿機(jī)勻漿或超聲破碎細(xì)胞，離心后提取蛋白，采用考馬斯亮藍(lán)法檢測(cè)蛋白濃度，蛋白上樣量為60μg，體積為20μl。配制10％聚丙烯酰胺凝膠，煮樣后電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉（5％脫脂牛奶）

8、、加入一抗4℃孵育過(guò)夜，洗膜45分鐘，加入過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗，經(jīng)37℃孵育2小時(shí)后ECL發(fā)光（MF-ChemiBis），并計(jì)算光密度值。試驗(yàn)重復(fù)3次。
　　9、慢病毒介導(dǎo)的shRNA的導(dǎo)入
　　采用MOI值為10∶1的病毒感染骨骼肌細(xì)胞，48小時(shí)后，在熒光顯微鏡(FV1000S-SIM/IX81;Olympus)下觀察GFP熒光標(biāo)記shRNA，明確感染效率。
　　10、細(xì)胞增殖檢測(cè)
　　骨骼肌細(xì)胞接種于96孔板

9、，生長(zhǎng)至70％，經(jīng)二氯化鈷處理后依次加入MTT及DMSO，用ELISA96孔板機(jī)器(BIORAD680，USA)檢測(cè)570nm處波長(zhǎng)，數(shù)據(jù)顯示為實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞相對(duì)對(duì)照組細(xì)胞的百分比。
　　11、流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡
　　細(xì)胞經(jīng)胰酶消化收集并PBS洗滌，按照BD公司AnnexinⅤ-FITC&PI凋亡試劑盒說(shuō)明操作，樣本經(jīng)流式細(xì)胞儀(FACSCaliber,USA)檢測(cè)。
　　12、流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期
　　胰酶消

10、化細(xì)胞，75％冰乙醇-20℃固定過(guò)夜，PBS洗滌一次，100ng/mlRNase及10ng/mlPI37℃染色1小時(shí)。流式細(xì)胞儀(FACSCaliber,USA)檢測(cè)細(xì)胞周期，同時(shí)ModFitLT3.0軟件分析細(xì)胞周期分布情況。
　　13、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
　　所有數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。組內(nèi)數(shù)據(jù)比較采用配對(duì)樣本t檢驗(yàn)。P＜0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果
　　1、急性缺血模型中骨骼肌和相關(guān)酶類的變化
　　急

11、性缺血模型是通過(guò)結(jié)扎左側(cè)髂內(nèi)、外動(dòng)脈及股動(dòng)脈構(gòu)成的。為了研究骨骼肌在急性缺血時(shí)組織形態(tài)學(xué)的變化，我們于不同缺血時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行HE染色。結(jié)果顯示，在對(duì)照組中HE染色無(wú)任何明顯變化，肌纖維排列規(guī)整，胞膜完整;實(shí)驗(yàn)組缺血4h、8h、12h和24h肌纖維受到損害，肌纖維寬窄不一，胞漿染色變淺，特別在缺血8h，而12h和24h未見(jiàn)明顯加重。在透射電鏡下也觀察到相同的結(jié)果。此外，乳酸脫氫酶及肌酸激酶的檢測(cè)也證明了以上的結(jié)論。在缺血4h和8h乳酸脫氫酶及

12、肌酸激酶釋放量升高最明顯，在8h達(dá)到高峰。實(shí)驗(yàn)證明，在急性缺血過(guò)程中骨骼肌存在著特異性的變化趨勢(shì)。
　　2、急性肢體缺血導(dǎo)致進(jìn)行性骨骼肌損傷對(duì)MG53和HIF-1α表達(dá)的影響
　　為研究MG53和HIF-1α表達(dá)與骨骼肌完整性之間是否存在一定聯(lián)系，通過(guò)實(shí)時(shí)定量PCR和免疫印跡來(lái)檢測(cè)MG53和HIF-1α在急性肢體缺血模型中的表達(dá)情況。數(shù)據(jù)顯示在急性缺血過(guò)程中，mRNA和蛋白水平上發(fā)現(xiàn)MG53和HIF-1α的表達(dá)呈進(jìn)行性升高。

13、實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在急性缺血過(guò)程中，MG53和HIF-1α可能存在相似的變化趨勢(shì)。
　　3、氯化鈷誘導(dǎo)原代骨骼肌細(xì)胞急性缺氧模型中MG53和HIF-1α的表達(dá)趨勢(shì)
　　采用特異性抗體橫紋肌肌動(dòng)蛋白鑒定原代培養(yǎng)的骨骼肌細(xì)胞。經(jīng)過(guò)200uM氯化鈷處理原代骨骼肌細(xì)胞分別于0h（對(duì)照組）、4h、8h、12h和24h檢測(cè)MG53和HIF-1α的表達(dá)趨勢(shì)。結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，缺氧的骨骼肌細(xì)胞活力明顯下降，同時(shí)也伴隨著MG53和HIF-1

14、αmRNA和蛋白水平上有相同升高的趨勢(shì)，實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證明兩者之間可能存在的相關(guān)性。
　　4、二氯化鈷誘導(dǎo)骨骼肌細(xì)胞凋亡和阻滯細(xì)胞周期進(jìn)程
　　二氯化鈷處理的骨骼肌細(xì)胞活力隨時(shí)間的延長(zhǎng)而下降?？沟蛲龅鞍譈cl-2與骨骼肌細(xì)胞活力的趨勢(shì)相似，而促凋亡蛋白BAX則隨著時(shí)間的延長(zhǎng)而上升，與骨骼肌細(xì)胞活力相反。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)骨骼肌細(xì)胞凋亡明顯增加。實(shí)驗(yàn)證明二氯化鈷能誘導(dǎo)骨骼肌細(xì)胞凋亡。同樣，二氯化鈷處理的骨骼肌細(xì)胞G0/G1期明顯增多，

15、S期明顯減少。同樣細(xì)胞周期抑制蛋白p27蛋白表達(dá)明顯增加，因此我們認(rèn)為二氯化鈷能夠阻滯骨骼細(xì)胞周期進(jìn)程，促使細(xì)胞聚集在G0/G1期。
　　5、HIF-1α和MG53對(duì)骨骼肌細(xì)胞的影響
　　采用慢病毒載體攜帶HIF-1α-shRNA和MG53-shRNA分別將其表達(dá)抑制，結(jié)果顯示:與對(duì)照組相比，HIF-1α-shRNA和MG53-shRNA細(xì)胞凋亡明顯增加，抑制細(xì)胞周期進(jìn)程;施加二氯化鈷誘導(dǎo)骨骼肌細(xì)胞后，結(jié)果顯示:與對(duì)照組相比

16、，HIF-1α-shRNA和MG53-shRNA細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期抑制更加明顯。說(shuō)明HIF-1α和MG53的缺失能夠引起骨骼肌細(xì)胞的損傷，在缺氧條件下能夠加重?fù)p傷。再次說(shuō)明兩者對(duì)骨骼肌細(xì)胞具有相似的作用。
　　6、HIF-1α和MG53之間的關(guān)系
　　采用慢病毒載體攜帶HIF-1α-shRNA和MG53-shRNA分別將其表達(dá)抑制，轉(zhuǎn)染后免疫印跡顯示HIF-1α的沉默表達(dá)能夠抑制HIF-1α和MG53的表達(dá)。相反，MG53的

17、下調(diào)僅抑制其本身的表達(dá)。因此，推測(cè)MG53可能是由HIF-1α調(diào)控的一個(gè)新下游因子。
　　結(jié)論
　　1、急性下肢缺血過(guò)程中骨骼肌損傷存在特異性的變化趨勢(shì);
　　2、急性下肢缺血過(guò)程中HIF-1α和MG53表達(dá)進(jìn)行性升高;
　　3、二氯化鈷誘導(dǎo)骨骼肌細(xì)胞缺氧過(guò)程中HIF-1α和MG53表達(dá)進(jìn)行性升高;
　　4、二氯化鈷誘導(dǎo)骨骼肌細(xì)胞凋亡和阻滯細(xì)胞周期進(jìn)程;
　　5、HIF-1α和MG53對(duì)骨骼肌細(xì)胞起到