2023年全國碩士研究生考試考研英語一試題真題(含答案詳解+作文范文)_第1頁
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1、肌肉細胞特異性增強因子2基因(Myocytespecifific-enhancerfactor2,MEF2)廣泛存在于果蠅、斑馬魚、小鼠和人類中。在小鼠和人類中,MEF2基因家族至少存在4個成員:MEF2A,MEF2B,MEF2C和MEF2D。其中MEF2A在骨骼肌細胞的發(fā)育、分化過程中發(fā)揮著關鍵作用。人類家系遺傳分析表明突變的MEF2A是冠狀動脈粥樣硬化的致病基因之一,這一致病基因的發(fā)現(xiàn)為研究冠心病的發(fā)病機理、開發(fā)預防和治療相關的新藥

2、具有重要價值。分子遺傳學篩查發(fā)現(xiàn)冠心病患者中近2﹪可能攜帶有MEF2A突變基因,這就提示MEF2A基因突變與冠心病及心梗有直接相關性,MEF2A基因在冠心病發(fā)病過程中有重要功能,但具體機制尚不清楚。最近,上述結(jié)論引起爭議。MEF2A基因敲除小鼠出生后死于猝死,MEF2A雜合性突變體小鼠出生后發(fā)育正常,MEF2A-/-小鼠死因不明。 模式生物作為研究基因功能的一種新型的研究方法,斑馬魚胚胎透明、體外發(fā)育、個體小、繁殖率高、產(chǎn)卵時

3、間長、以及魚種發(fā)育遺傳背景清晰等優(yōu)點使其正成為研究脊椎動物發(fā)育生物學、發(fā)育遺傳學的理想模式生物。斑馬魚屬于脊椎動物,其心血管、血液、消化道、肝臟、腎臟以及視覺系統(tǒng)與人類相應系統(tǒng)有許多共同特點。用該模型闡明早期發(fā)育、器官形成、系統(tǒng)生理學、藥理學和復雜疾病等問題均切實可行。2000年,Nasevicius等提出了注射嗎啡啉修飾性寡核苷酸可獲得基因下調(diào)斑馬魚。嗎啡啉有抑制翻譯的起始,減少傳統(tǒng)反義寡核苷酸非特異性的效應。注射嗎啡啉能夠產(chǎn)生以往證

4、實的基因突變的擬表型,有助于確定未知功能的基因。嗎啡啉寡核苷酸正在成為快速、高效的基因敲除方法,使經(jīng)典反向遺傳學方法應用于斑馬魚。 斑馬魚具有許多適合心血管系統(tǒng)疾病研究的優(yōu)勢,斑馬魚的心臟容易觀察和便于操作,更有意義的是,由于它的胚胎小,可以不依賴于有功能的心血管系統(tǒng),甚至在整個心血管循環(huán)缺失的情況下,它仍然能通過對氧的被動運輸而生存,繼續(xù)發(fā)育一段時間,這就可以活體觀察心血管系統(tǒng)有嚴重缺陷的突變體,為心血管發(fā)育遺傳學研究提供極

5、為有利條件亡,此外,斑馬魚與人類的心臟發(fā)育具有極其相似的基因調(diào)控途徑,因此進行斑馬魚的心臟發(fā)育機制研究,對揭示人類心臟發(fā)育的基因調(diào)控機理有重要的啟示意義,這使得斑馬魚成為進行心臟發(fā)育生物學研究的重要模式動物之一,極大地推動心血管疾病發(fā)病機制的研究。 應用斑馬魚正向遺傳學(forwardgenetics)研究已鑒定了多個影響心臟收縮功能的突變體。突變體weakatrium心房停止跳動,而心室正常節(jié)律性收縮;silentheart

6、是心臟收縮功能缺陷最嚴重的突變體,其心房和心室都停止跳動,但心房和心室外形發(fā)育正常;突變體quietheart心房和心室?guī)缀跬V固鴦?,但心房和心室外形發(fā)育正常;突變體stretched心房和心室跳動但無血液循環(huán),胚胎發(fā)育到48小時時,純合子突變體stretched嚴重水腫,整個心臟形成針樣結(jié)構。定位克隆結(jié)果證明上述突變基因是形成肌節(jié)的結(jié)構蛋白質(zhì)的相應編碼基因,心肌肌原纖維由粗、細肌絲規(guī)律排列組成,心肌肌節(jié)是心肌收縮的基本元件,肌絲的滑動

7、是心肌收縮的動力基礎。構成肌節(jié)的結(jié)構蛋白質(zhì)突變可導致擴張型心肌病或肥厚型心肌病,甚至心力衰竭。到目前為止,在大規(guī)模斑馬魚遺傳篩選中,還沒有突變體的突變基因遺傳定位到MEF2A位點。 BMP-2是參與胚胎早期分化發(fā)育的又一個因子,有趣的是,發(fā)育后期機體BMP-2基因仍有表達,提示BMP-2基因在發(fā)育后期仍有生物學功能,但BMP-2基因敲除小鼠在早期胚胎7.0-10.5天時就死亡,妨礙了探討B(tài)MP-2基因在發(fā)育后期的功能。

8、 到目前為止,還沒有直接的遺傳學證據(jù)表明BMP-2調(diào)節(jié)心臟收縮。本研究得利于斑馬魚在心血管發(fā)育遺傳學中的優(yōu)勢,BMP-2基因敲除小鼠在早期胚胎死亡,所以用小鼠模型研究發(fā)育后期BMP-2基因功能很困難。相反,斑馬魚胚胎發(fā)育并不完全依賴有功能的心血管系統(tǒng),環(huán)境中的氧可以擴散進入胚胎機體。這就為探討B(tài)MP-2基因功能提供可能。我們實驗證明,心肌細胞可以合成并分泌BMP-2,BMP-2不僅是背腹分化所必需的,也是維持心臟收縮所不可缺的。

9、 新生大鼠心肌細胞模型作為一種體外實驗研究模型,可以更方便地從細胞和分子水平研究心血管疾病的發(fā)病機制,成為心血管疾病研究的一項主要手段和基本技術。 體節(jié)發(fā)育過程受多種遺傳因子調(diào)節(jié),有趣的是斑馬魚前6個體節(jié)每20分鐘形成1個體節(jié),而后24個體節(jié)每30分鐘形成1個體節(jié),表明前部體節(jié)和后部體節(jié)發(fā)育機理不完全相同。斑馬魚大規(guī)模遺傳篩選獲得多個體節(jié)發(fā)育缺陷突變體,還沒有突變體遺傳定位到MEF2A位點。 第一部分MEF2A在

10、斑馬魚心臟發(fā)育中的作用 本部分研究擬利用斑馬魚在心血管發(fā)育遺傳學優(yōu)勢,探討MEF2A基因在斑馬魚心臟發(fā)育中的作用。 首先,利用RT-PCR,胚胎整體原位雜交和MEF2A:GFP轉(zhuǎn)基因斑馬魚的動態(tài)分析等多種手段探討MEF2A在胚胎發(fā)育中的表達模式,表明MEF2A在斑馬魚胚胎發(fā)育過程中在心臟及體節(jié)中有表達,在心臟中的表達提示MEF2A在心臟發(fā)育中有某種特定功能。 其后,利用嗎啡啉修飾的寡核苷酸技術在整體水平下調(diào)

11、(knock-down)MEF2A基因的表達,探討其異常表型及其機制。發(fā)現(xiàn): 1.胚胎發(fā)育到48小時時,胚胎心臟形態(tài)發(fā)生正常。但心臟收縮頻率降低,心室收縮指數(shù)降低,心肌收縮力降低,整體動物實驗提示MEF2A參與心臟的收縮功能。 2.心肌電鏡結(jié)果提示MEF2A參與心肌肌節(jié)的組裝,MEF2A功能下調(diào)導致心肌肌節(jié)的組裝紊亂,細胞水平證明MEF2A的功能完整是心臟正常收縮所必需的。 3.Real-TimePCR、原

12、位免疫熒光實驗技術顯示MEF2A的表達下調(diào)能導致參與心肌收縮基因的表達異常,這些收縮基因的表達產(chǎn)物收縮蛋白是形成心肌肌節(jié)的基本元件,是參與心肌收縮的動力裝置。從分子水平證明MEF2A參與心臟的收縮功能。 第二部分BMP2作用于MEF2A上游調(diào)節(jié)心臟收縮 第一部分我們提供了MEF2A調(diào)節(jié)心臟收縮的功能的遺傳學基礎,MEF2A作為一個轉(zhuǎn)錄因子,其上游的調(diào)節(jié)機制還很少有報道。 本部分研究綜合利用斑馬魚和心肌細胞模

13、型,首先,分析了斑馬魚、大鼠和人的BMP-2和MEF2A高度同源;其次,證明BMP-2和MEF2A在胚胎心臟中共同表達;再次,提供BMP2調(diào)節(jié)心臟收縮的遺傳學證據(jù);第四,用生化手段證明BMP-2可以調(diào)控新生大鼠心室心肌細胞MEF-2A的表達;第五,用功能恢復手段證明MEF2A作用于BMP2下游調(diào)節(jié)心臟收縮;第六,提出BMP2-MEF2A通路調(diào)節(jié)心臟收縮的模型,分析靶向BMP2-MEF2A通路可以為心力衰竭的防治提供新的手段。

14、第三部分MEF2A在斑馬魚體節(jié)發(fā)育中的作用 第一部分我們證明MEF2A在斑馬魚胚胎發(fā)育過程中在體節(jié)中有表達,在體節(jié)中的表達提示MEF2A在體節(jié)發(fā)育中有某種特定功能。 體節(jié)發(fā)育過程受多種遺傳因子調(diào)節(jié),有趣的是斑馬魚前6個體節(jié)每20分鐘形成1個,而后24個體節(jié)每30分鐘形成1個,表明前部體節(jié)和后部體節(jié)發(fā)育機理不完全相同。斑馬魚大規(guī)模遺傳篩選獲得多個體節(jié)發(fā)育缺陷突變體,還沒有突變體遺傳定位到MEF2A位點。 本部

15、分研究利用斑馬魚在體外發(fā)育、胚胎透明、發(fā)育快速的特點,探討MEF2A基因在斑馬魚在體節(jié)的作用。利用嗎啡啉修飾的寡核苷酸技術在整體水平下調(diào)MEF2A基因的表達,探討體節(jié)發(fā)育缺陷表型其異常表型,發(fā)現(xiàn) 1.斑馬魚胚胎MEF2A下調(diào)后尾部向下彎曲,形成U型的后部體節(jié); 2.MEF2A是Hedgehog通路所必需的,盡管MEF2A不影響shh,ehh的表達; 3.MEF2A下調(diào)后導致后部體節(jié)凋亡增加; 4.

16、Hedgehog信號抑制MEF2A的表達; 5.利用表達譜基因芯片技術探討MEF2A基因下調(diào)后的基因表達改變, 為研究MEF2A下游的靶基因提供的源泉。 上述實驗證明MEF2A是斑馬魚后部體節(jié)發(fā)育所必需的 第四部分Wortmannin誘導斑馬魚“雙心畸形” 本論文第一、二部分我們證明BMP-2及MEF2A調(diào)節(jié)心臟收縮的功能,等報道磷脂酰肌醇激酶3(PI-3-K)可以負性調(diào)節(jié)離體培養(yǎng)心肌細

17、胞的收縮,我們想探討PI-3-K能否調(diào)節(jié)斑馬魚胚胎心臟收縮,與BMP-2及MEF2A之間有無某種調(diào)節(jié)作用,我們用一種很常用的PI-3-K的抑制劑wortmannin誘導斑馬魚胚胎,結(jié)果發(fā)現(xiàn)處理的胚胎“雙心畸形”的表型,引起我們的關注。 本部分我們首次報道wortmannin誘導斑馬魚胚胎“雙心畸形”。首先用原位免疫熒光方法及整體原位雜交的方法證明wortmannin可誘導二個獨立的心臟,再次,證明wortmannin誘導斑馬魚

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