Nrxn2a在鉛誘導(dǎo)的斑馬魚神經(jīng)發(fā)育毒性中的作用.pdf

1、目的:長期低劑量的鉛暴露可引起神經(jīng)系統(tǒng)損傷，對處于生長發(fā)育階段的嬰幼兒尤甚，并可進(jìn)一步引起神經(jīng)系統(tǒng)紊亂以及行為改變。在神經(jīng)生長發(fā)育過程中，突觸粘附分子發(fā)揮著重要的作用，但其在鉛的神經(jīng)發(fā)育毒性中的作用尚不明確。本研究通過觀察鉛暴露對斑馬魚神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育的影響，以探索斑馬魚突觸粘附分子在鉛暴露作用下的表達(dá)改變以及在斑馬魚行為改變中的作用。
　　方法:1.觀察單細(xì)胞期不同劑量的醋酸鉛(Pb(CH3COOH)2)暴露對斑馬魚胚胎/幼魚死亡、

2、畸形、孵化的影響;
　　2.采用吖啶橙(Acridine Orange)染色法觀察受精后3天(3dpf)斑馬魚全魚細(xì)胞凋亡狀況;
　　3.使用電感耦合等離子體質(zhì)譜法(ICP-MS)測定鉛的斑馬魚內(nèi)暴露含量;
　　4.利用ViewPoint Zebrabox行為測試系統(tǒng)觀測斑馬魚幼魚自發(fā)運動行為變化。
　　5.通過q-PCR以及全魚原位雜交(In-Situ Hybridization，ISH)技術(shù)定量及定位24hp

3、f，48hpf以及72hpf斑馬魚體內(nèi)各亞型neurexin（nrxn）以及72hpf部分突觸粘附分子mRNA表達(dá)水平與空間表達(dá)狀況;
　　6.采用顯微注射技術(shù)于斑馬魚胚胎單細(xì)胞期注射人工合成的nrxn2ab mRNA進(jìn)行進(jìn)行拯救實驗(rescue experiment)，進(jìn)一步觀察過表達(dá)nrxn2ab mRNA后，鉛暴露下斑馬魚胚胎/幼魚的死亡、畸形、孵化狀況，凋亡發(fā)生，nrxn2aa與nrxn2ab表達(dá)變化以及行為學(xué)改變。

4、r>　　結(jié)果:1.隨著鉛暴露劑量的增加，斑馬魚胚胎死亡率和畸形率有不同程度的升高。持續(xù)暴露至120hpf時，最高受試劑量(10μmol/L)引起斑馬魚幼魚死亡率約為18％;鉛暴露可使斑馬魚出現(xiàn)多種畸形表型，主要表現(xiàn)為脊柱彎曲畸形，于120hpf畸形率達(dá)26％。
　　2.AO染色凋亡顯示斑馬魚幼魚凋亡水平隨著暴露劑量的增加而升高，其中凋亡發(fā)生主要聚集于頭部、心包以及魚鰭等區(qū)域。在NBT-DsRed轉(zhuǎn)基因魚系（特異性標(biāo)記神經(jīng)元）中，鉛

5、暴露引起較明顯的神經(jīng)系統(tǒng)凋亡;
　　3.ICP-MS結(jié)果顯示鉛有較強(qiáng)的生物蓄積作用，并伴有劑量效應(yīng)關(guān)系;
　　4.在行為學(xué)觀察中，可見在受試濃度下的斑馬魚的自發(fā)運動受到了抑制，表現(xiàn)為總運動位移的減少、活動比例以及平均速度的降低，并隨著暴露劑量的升高而運動行為抑制增加。
　　5.通過qPCR檢測鉛暴露對受試突觸粘附分子mRNA水平表達(dá)的影響，結(jié)果顯示僅nrxn2a基因表達(dá)受到鉛暴露的影響。qPCR和原位雜交實驗展示了斑馬

6、魚各亞型的nrxn的mRNA水平表達(dá)狀況。鉛暴露于各測試時間點對nrxn2aa和nrxn2ab的表達(dá)均具有較明顯的抑制作用。其中鉛暴露于24hpf誘導(dǎo)了nrxn1a和nrxn3a的表達(dá)并于48hpf產(chǎn)生抑制作用，而至72hpf則無明顯改變。
　　6.在拯救實驗中，觀察nrxn2ab mRNA注射后斑馬魚胚胎生長發(fā)育狀況，發(fā)現(xiàn)mRNA注射可明顯減少鉛暴露導(dǎo)致的脊柱畸形發(fā)生同時降低神經(jīng)系統(tǒng)（NBT-dsRed轉(zhuǎn)基因魚）和全魚（野生型）