Nrf2-HO-1通路在鉛致神經(jīng)毒性中的保護(hù)作用研究.pdf

1、鉛污染已成為全球公共衛(wèi)生問(wèn)題之一。鉛是一種廣泛持久存在于環(huán)境中的污染物，它可以對(duì)各種生物體產(chǎn)生危害。由于神經(jīng)系統(tǒng)是鉛的主要靶器官，因此鉛引起的健康危害一直備受關(guān)注。但是，鉛神經(jīng)毒作用機(jī)制迄今仍未很明確。已有研究報(bào)道鉛致神經(jīng)毒性可能與細(xì)胞的氧化應(yīng)激有關(guān)。為此，本研究主要圍繞抗氧化功能調(diào)控的核因子E2相關(guān)因子2（nuclear factor erythroid2-related factor, Nrf2）/血紅素加氧酶1（heme oxyg

2、enase1, HO-1）通路開(kāi)展了相關(guān)研究，旨在揭示此通路在抵御鉛致神經(jīng)毒性中的分子機(jī)制，為鉛致神經(jīng)系統(tǒng)損害的防御新策略提供科學(xué)依據(jù)。
　　第一部分：Nrf2在鉛致神經(jīng)毒性中的保護(hù)作用研究
　　目的：探討Nrf2轉(zhuǎn)錄因子在鉛致神經(jīng)毒性中的作用。
　　方法：用設(shè)定濃度的醋酸鉛（lead acetate, PbAc）處理SH-SY5Y細(xì)胞，用CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞存活率、DCHF熒光探針?lè)z測(cè)胞內(nèi)ROS水平、Annexin

3、 V FITC-PI法檢測(cè)細(xì)胞凋亡率，Western Blot法檢測(cè)細(xì)胞核中Nrf2的含量以及HO-1和γ谷氨酰半胱氨酸合成酶（γ-glutamylcysteine synthetase,γ-GCS）的含量，q-RT-PCR法檢測(cè)Hmox1、谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶α1（glutathione S-transferase alpha1, GSTα1）、谷氨酰半胱氨酸連接酶催化亞基（glutamate-cysteine ligase catalyt

4、ic subunit, GCLC）、谷氨酰半胱氨酸連接酶調(diào)節(jié)亞基（glutamate-cysteine ligase, regulatory subunit, GCLM）和苯醌氧化還原酶（NAD(P)H:quinoneoxidoreductase, NQO1）的mRNA水平。用小RNA干擾（small interfering RNA, siRNA）技術(shù)敲降細(xì)胞中 Nrf2后，檢測(cè)上述基因的mRNA水平和蛋白表達(dá)水平。用乙酰半胱氨酸（ac

5、etyl-L-cysteine, NAC）和二苯基碘酰氯（diphenyliodonium chloride, DPI）處理細(xì)胞后，檢測(cè)細(xì)胞存活率。PbAc處理經(jīng)轉(zhuǎn)染pCMV-Nrf2過(guò)表達(dá)Nrf2的細(xì)胞，檢測(cè)細(xì)胞存活率、胞內(nèi)ROS水平、細(xì)胞凋亡率和Bax、Bcl2、CytoC、pro-Caspase3的蛋白水平。
　　結(jié)果：PbAc主要誘導(dǎo)了細(xì)胞的氧化應(yīng)激介導(dǎo)的神經(jīng)毒作用；NAC和DPI具有抗氧化作用并能顯著抑制PbAc的細(xì)胞毒

6、性。PbAc可激活轉(zhuǎn)錄因子Nrf2轉(zhuǎn)位入核與抗氧化反應(yīng)元件（antioxidant response element, ARE）區(qū)域結(jié)合，并能啟動(dòng)下游基因的表達(dá)。PbAc激活了基因Hmox1、Gstα1、Gclc、Gclm和Nqo1的轉(zhuǎn)錄，同時(shí)伴有HO-1和γ-GCS蛋白表達(dá)的上調(diào)。當(dāng)敲降Nrf2基因則顯著抑制上述基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)。過(guò)表達(dá)Nrf2可抑制PbAc誘導(dǎo)的活性氧簇（reactive oxygen species, ROS）積累

7、和細(xì)胞凋亡，提高細(xì)胞存活率。
　　結(jié)論：Nrf2-ARE系統(tǒng)在鉛致神經(jīng)凋亡中具有保護(hù)作用。
　　第二部分：HO-1在鉛致神經(jīng)毒性中的保護(hù)作用研究
　　目的：探討HO-1轉(zhuǎn)錄因子在鉛致神經(jīng)毒性中的作用。
　　方法：用PbAc分別處理大鼠原代海馬神經(jīng)細(xì)胞和SH-SY5Y細(xì)胞后，檢測(cè)HO-1的蛋白水平和mRNA水平。用PbAc處理SH-SY5Y細(xì)胞后，檢測(cè)P38、ERK1/2、JNK、STAT3和PI3K/AKT信號(hào)通

8、路的變化。用上述通路特異性抑制劑處理后，檢測(cè)HO-1的蛋白水平。過(guò)表達(dá)或敲降細(xì)胞HO-1后，檢測(cè)細(xì)胞存活率、胞內(nèi)ROS水平、細(xì)胞凋亡率和Bax、Bcl2、Bcl-xl的蛋白表達(dá)水平。
　　結(jié)果：PbAc分別處理大鼠原代海馬神經(jīng)細(xì)胞和SH-SY5Y細(xì)胞后，胞內(nèi)ROS水平升高，細(xì)胞凋亡率增高，PbAc誘導(dǎo)HO-1在mRNA和蛋白水平的表達(dá)。進(jìn)一步研究顯示，PbAc激活了ROS依賴性P38、ERK1/2和PI3K/AKT信號(hào)通路，以及R

9、OS非依賴性JNK信號(hào)通路，促進(jìn)了HO-1的表達(dá)。當(dāng)細(xì)胞內(nèi)過(guò)表達(dá)HO-1時(shí)，可顯著降低鉛致 ROS積累和細(xì)胞凋亡。但是，敲降 HO-1后則促使細(xì)胞內(nèi)ROS產(chǎn)生和細(xì)胞凋亡。
　　結(jié)論：HO-1能有效抑制鉛誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激和細(xì)胞凋亡而產(chǎn)生保護(hù)作用。
　　第三部分：t-BHQ激活Nrf2/HO-1通路抑制鉛神經(jīng)毒性
　　方法：用Nrf2的激活劑特丁基對(duì)苯二酚（tertiary butylhydroquinone, t-BHQ）

10、和PbAc聯(lián)合處理發(fā)育期SD大鼠后，檢測(cè)海馬和皮層中丙二醛（methane dicarboxylic aldehyde, MDA）水平、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase, SOD）和還原型谷胱甘肽（glutathione, GSH）活性；用Nissl染色檢測(cè)大鼠海馬神經(jīng)元的變性死亡和存活情況并檢測(cè)了Nrf2蛋白含量和Nrf2-ARE結(jié)合力。用t-BHQ、放線菌酮（cyclohexane，CHX）或放線菌素D（ac

11、tinomycin D, Act.D）先處理SH-SY5Y細(xì)胞后，再用PbAc染毒后，檢測(cè)Nrf2或HO-1的mRNA和蛋白表達(dá)水平。分別敲降細(xì)胞Nrf2和HO-1后，檢測(cè)細(xì)胞存活率、胞內(nèi)ROS水平、Caspase3/7酶活力以及Bax和Bcl2蛋白的表達(dá)水平。
　　結(jié)果：整體動(dòng)物實(shí)驗(yàn)顯示，在發(fā)育期大鼠腦組織的海馬和皮層中，t-BHQ降低了MDA水平，誘導(dǎo)了超氧化物歧化酶（superoxide dismutase, SOD）和GS

12、H活性，顯著地改善了PbAc誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激。而且，t-BHQ抑制了PbAc所致的海馬和皮層區(qū)域的神經(jīng)元凋亡。細(xì)胞實(shí)驗(yàn)顯示，t-BHQ降低了 PbAc誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞內(nèi)ROS的積累和Capsase3/7活性，但增加了胞內(nèi)GSH含量。t-BHQ促進(jìn)了 Nrf2轉(zhuǎn)位入核并與 ARE結(jié)合，雖然 Nrf2的轉(zhuǎn)錄水平未見(jiàn)上升，但促進(jìn)了Hmox1、Nqo1和Gclc等基因的表達(dá)。當(dāng)分別敲降SH-SY5Y細(xì)胞內(nèi)Nrf2和HO-1，則觀察到細(xì)胞的