Nrf2-HO-1通路在鉛致神經毒性中的保護作用研究.pdf

1、鉛污染已成為全球公共衛(wèi)生問題之一。鉛是一種廣泛持久存在于環(huán)境中的污染物，它可以對各種生物體產生危害。由于神經系統(tǒng)是鉛的主要靶器官，因此鉛引起的健康危害一直備受關注。但是，鉛神經毒作用機制迄今仍未很明確。已有研究報道鉛致神經毒性可能與細胞的氧化應激有關。為此，本研究主要圍繞抗氧化功能調控的核因子E2相關因子2（nuclear factor erythroid2-related factor, Nrf2）/血紅素加氧酶1（heme oxyg

2、enase1, HO-1）通路開展了相關研究，旨在揭示此通路在抵御鉛致神經毒性中的分子機制，為鉛致神經系統(tǒng)損害的防御新策略提供科學依據。
　　第一部分：Nrf2在鉛致神經毒性中的保護作用研究
　　目的：探討Nrf2轉錄因子在鉛致神經毒性中的作用。
　　方法：用設定濃度的醋酸鉛（lead acetate, PbAc）處理SH-SY5Y細胞，用CCK-8法檢測細胞存活率、DCHF熒光探針法檢測胞內ROS水平、Annexin

3、 V FITC-PI法檢測細胞凋亡率，Western Blot法檢測細胞核中Nrf2的含量以及HO-1和γ谷氨酰半胱氨酸合成酶（γ-glutamylcysteine synthetase,γ-GCS）的含量，q-RT-PCR法檢測Hmox1、谷胱甘肽轉移酶α1（glutathione S-transferase alpha1, GSTα1）、谷氨酰半胱氨酸連接酶催化亞基（glutamate-cysteine ligase catalyt

4、ic subunit, GCLC）、谷氨酰半胱氨酸連接酶調節(jié)亞基（glutamate-cysteine ligase, regulatory subunit, GCLM）和苯醌氧化還原酶（NAD(P)H:quinoneoxidoreductase, NQO1）的mRNA水平。用小RNA干擾（small interfering RNA, siRNA）技術敲降細胞中 Nrf2后，檢測上述基因的mRNA水平和蛋白表達水平。用乙酰半胱氨酸（ac

5、etyl-L-cysteine, NAC）和二苯基碘酰氯（diphenyliodonium chloride, DPI）處理細胞后，檢測細胞存活率。PbAc處理經轉染pCMV-Nrf2過表達Nrf2的細胞，檢測細胞存活率、胞內ROS水平、細胞凋亡率和Bax、Bcl2、CytoC、pro-Caspase3的蛋白水平。
　　結果：PbAc主要誘導了細胞的氧化應激介導的神經毒作用；NAC和DPI具有抗氧化作用并能顯著抑制PbAc的細胞毒

6、性。PbAc可激活轉錄因子Nrf2轉位入核與抗氧化反應元件（antioxidant response element, ARE）區(qū)域結合，并能啟動下游基因的表達。PbAc激活了基因Hmox1、Gstα1、Gclc、Gclm和Nqo1的轉錄，同時伴有HO-1和γ-GCS蛋白表達的上調。當敲降Nrf2基因則顯著抑制上述基因的轉錄和表達。過表達Nrf2可抑制PbAc誘導的活性氧簇（reactive oxygen species, ROS）積累

7、和細胞凋亡，提高細胞存活率。
　　結論：Nrf2-ARE系統(tǒng)在鉛致神經凋亡中具有保護作用。
　　第二部分：HO-1在鉛致神經毒性中的保護作用研究
　　目的：探討HO-1轉錄因子在鉛致神經毒性中的作用。
　　方法：用PbAc分別處理大鼠原代海馬神經細胞和SH-SY5Y細胞后，檢測HO-1的蛋白水平和mRNA水平。用PbAc處理SH-SY5Y細胞后，檢測P38、ERK1/2、JNK、STAT3和PI3K/AKT信號通

8、路的變化。用上述通路特異性抑制劑處理后，檢測HO-1的蛋白水平。過表達或敲降細胞HO-1后，檢測細胞存活率、胞內ROS水平、細胞凋亡率和Bax、Bcl2、Bcl-xl的蛋白表達水平。
　　結果：PbAc分別處理大鼠原代海馬神經細胞和SH-SY5Y細胞后，胞內ROS水平升高，細胞凋亡率增高，PbAc誘導HO-1在mRNA和蛋白水平的表達。進一步研究顯示，PbAc激活了ROS依賴性P38、ERK1/2和PI3K/AKT信號通路，以及R

9、OS非依賴性JNK信號通路，促進了HO-1的表達。當細胞內過表達HO-1時，可顯著降低鉛致 ROS積累和細胞凋亡。但是，敲降 HO-1后則促使細胞內ROS產生和細胞凋亡。
　　結論：HO-1能有效抑制鉛誘導的氧化應激和細胞凋亡而產生保護作用。
　　第三部分：t-BHQ激活Nrf2/HO-1通路抑制鉛神經毒性
　　方法：用Nrf2的激活劑特丁基對苯二酚（tertiary butylhydroquinone, t-BHQ）

10、和PbAc聯(lián)合處理發(fā)育期SD大鼠后，檢測海馬和皮層中丙二醛（methane dicarboxylic aldehyde, MDA）水平、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase, SOD）和還原型谷胱甘肽（glutathione, GSH）活性；用Nissl染色檢測大鼠海馬神經元的變性死亡和存活情況并檢測了Nrf2蛋白含量和Nrf2-ARE結合力。用t-BHQ、放線菌酮（cyclohexane，CHX）或放線菌素D（ac

11、tinomycin D, Act.D）先處理SH-SY5Y細胞后，再用PbAc染毒后，檢測Nrf2或HO-1的mRNA和蛋白表達水平。分別敲降細胞Nrf2和HO-1后，檢測細胞存活率、胞內ROS水平、Caspase3/7酶活力以及Bax和Bcl2蛋白的表達水平。
　　結果：整體動物實驗顯示，在發(fā)育期大鼠腦組織的海馬和皮層中，t-BHQ降低了MDA水平，誘導了超氧化物歧化酶（superoxide dismutase, SOD）和GS

12、H活性，顯著地改善了PbAc誘導的氧化應激。而且，t-BHQ抑制了PbAc所致的海馬和皮層區(qū)域的神經元凋亡。細胞實驗顯示，t-BHQ降低了 PbAc誘導的SH-SY5Y細胞內ROS的積累和Capsase3/7活性，但增加了胞內GSH含量。t-BHQ促進了 Nrf2轉位入核并與 ARE結合，雖然 Nrf2的轉錄水平未見上升，但促進了Hmox1、Nqo1和Gclc等基因的表達。當分別敲降SH-SY5Y細胞內Nrf2和HO-1，則觀察到細胞的