Nrf2-HO-1途徑對(duì)高脂飲食誘導(dǎo)的大鼠胰島素抵抗的保護(hù)作用和機(jī)制研究.pdf

1、背景
　　非酒精性脂肪性肝病（non-alcoholicfattyliverdisease，NAFLD）已成為一種較為常見(jiàn)的肝病。它是一種無(wú)過(guò)量飲酒史，以肝細(xì)胞脂肪儲(chǔ)積和脂肪變性為主要特征的臨床病理綜合征。其疾病譜隨著病情的進(jìn)展而表現(xiàn)不同，主要包括單純性脂肪肝、非酒精性脂肪性肝炎（non-alcoholicsteatohepatitis，NASH）、脂肪性肝纖維化和肝硬化。其中NASH是NAFLD發(fā)病過(guò)程中由單純性脂肪肝向肝硬化甚

2、至肝癌進(jìn)展的一個(gè)關(guān)鍵環(huán)節(jié)。NASH主要以脂肪浸潤(rùn)、肝細(xì)胞損害、炎癥和纖維化為特征。近年來(lái)隨著我國(guó)人民生活水平的提高，飲食結(jié)構(gòu)及生活方式均出現(xiàn)明顯改變，由此帶來(lái)NASH的發(fā)病率大幅提高。同時(shí)NASH在全球的發(fā)病率也呈現(xiàn)上升的趨勢(shì)。因此其越來(lái)越受到人們的重視。但是，NASH的發(fā)病機(jī)制至今仍未完全明確。目前較為成熟及完善的理論為―二次打擊‖學(xué)說(shuō)。此學(xué)說(shuō)認(rèn)為脂質(zhì)過(guò)氧化、氧化應(yīng)激及胰島素抵抗（insuinresistance，IR)在NASH的發(fā)

3、生和發(fā)展中起到重要作用。
　　NASH的發(fā)病與多種因素相關(guān)，IR、氧化應(yīng)激、脂質(zhì)過(guò)氧化、遺傳等因素均參與其發(fā)病過(guò)程。研究證實(shí)，IR常存在于NASH患者，IR是NASH的始動(dòng)因素而不是結(jié)果。IR狀態(tài)下，一方面產(chǎn)生大量的游離脂肪酸，且肝臟對(duì)脂肪酸的β-氧化作用減弱，合成極低密度脂蛋白的能力下降，導(dǎo)致大量脂質(zhì)沉積于肝細(xì)胞。另一方面肝細(xì)胞內(nèi)ATP儲(chǔ)備減少，氧化應(yīng)激反應(yīng)增強(qiáng)，共同導(dǎo)致肝臟損傷的形成。而氧化應(yīng)激又是引起IR的重要因素。氧化應(yīng)激

4、通過(guò)激活多種氧化還原敏感性激酶引起IR，如junN-末端激酶（junN-terminalkinase，JNK）通路活化可增加胰島素受體底物1（insulinreceptorsubstrate1，IRS-1）的絲氨酸磷酸化、進(jìn)而抑制胰島素信號(hào)通路轉(zhuǎn)導(dǎo)產(chǎn)生IR。
　　Nrf2-Keap1系統(tǒng)在機(jī)體對(duì)抗氧化應(yīng)激反應(yīng)過(guò)程中具有重要作用。其中轉(zhuǎn)錄因子NF-E2相關(guān)因子2（NF-E2-relatedfactor2，Nrf2）是一種非常重要的轉(zhuǎn)

5、錄因子，具有對(duì)抗氧化應(yīng)激的作用。當(dāng)受到外來(lái)氧化應(yīng)激刺激時(shí)它可以與抗氧化反應(yīng)元件(antioxidant-responseelement,ARE)相結(jié)合，從而上調(diào)Ⅱ相抗氧化酶尤其是血紅素氧合酶1（hemeoxygenase-1，HO-1）的表達(dá)對(duì)抗細(xì)胞氧化應(yīng)激。研究表明，HO-1對(duì)IR具有保護(hù)作用。HO-1通過(guò)其催化產(chǎn)物一氧化碳(carbonmonoxide，CO)、自由鐵(Fe)、膽綠素（(biliverdin，BV）和膽紅素(bili

6、mbin，BR)的抗氧化、抗炎活性改善IR。既往研究證實(shí)，在高脂飲食誘導(dǎo)的IR大鼠模型中，誘導(dǎo)HO-1的表達(dá)能顯著降低IR大鼠體內(nèi)的氧化損傷，改善IR水平。
　　我們前期的研究已證實(shí)姜黃素能夠促進(jìn)肝細(xì)胞Nrf2核轉(zhuǎn)位，對(duì)肝細(xì)胞氧化應(yīng)激具有保護(hù)作用。本實(shí)驗(yàn)利用姜黃素誘導(dǎo)Nrf2活化，增加Nrf2/HO-1途徑的活力，通過(guò)降低氧化應(yīng)激水平，觀察改善IR及對(duì)NASH的保護(hù)作用。
　　目的
　　本實(shí)驗(yàn)采用高脂飲食誘導(dǎo)的IR大鼠

7、模型及肝細(xì)胞LO2氧化應(yīng)激模型，通過(guò)Nrf2誘導(dǎo)劑進(jìn)行干預(yù)，觀察上調(diào)Nrf2/HO-1途徑對(duì)肝臟功能、病理、氧化應(yīng)激及IR相關(guān)指標(biāo)的影響，研究上調(diào)Nrf2/HO-1途徑能否對(duì)大鼠肝臟及肝細(xì)胞LO2的IR起到保護(hù)作用，為以Nrf2/HO-1途徑為靶點(diǎn)進(jìn)行NASH的防治提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)和理論依據(jù)。
　　方法
　　1.通過(guò)高脂飲食構(gòu)建IR大鼠模型。將大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、模型組及姜黃素干預(yù)組。對(duì)照組正常飲食，模型組及姜黃素干預(yù)組給予髙脂

8、飲食6wk。此后對(duì)照組及模型組繼續(xù)同前飲食，干預(yù)組給予髙脂飲食及姜黃素200mg/kg/d灌胃共4wk。10wk末westernblot法檢測(cè)Nrf2、HO-1及胰島素信號(hào)通路的表達(dá)，生化分析儀檢測(cè)肝功能，分光光度法檢測(cè)氧化應(yīng)激水平。
　　2.將人肝細(xì)胞LO2分為對(duì)照組、模型組、姜黃素干預(yù)組和抑制劑組。正常培養(yǎng)的肝細(xì)胞為對(duì)照組；通過(guò)100U/L的GO干預(yù)2h后的肝細(xì)胞為氧化應(yīng)激模型組；通過(guò)姜黃素30μM干預(yù)12h后再同模型組處理的

9、肝細(xì)胞為姜黃素干預(yù)組；通過(guò)抑制劑wortmannin作用1h后再同干預(yù)組處理的肝細(xì)胞為抑制劑組。Westernblot法觀察Nrf2、HO-1及胰島素信號(hào)通路的表達(dá)，分光光度法檢測(cè)細(xì)胞氧化應(yīng)激水平，速率法檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)液中AST、ALT水平。葡萄糖氧化酶-過(guò)氧化物酶方法對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)液中葡萄糖含量進(jìn)行檢測(cè)。
　　結(jié)果
　　1.通過(guò)髙脂飲食成功建立了IR大鼠模型。采用胰島素-正常血糖鉗夾試驗(yàn)表明模型組大鼠葡萄糖輸注速率（GIR）顯著

10、低于對(duì)照組大鼠(P＜0.01)。
　　2.分光光度法檢測(cè)各組大鼠氧化應(yīng)激指標(biāo)結(jié)果示：大鼠肝臟MDA水平模型組較對(duì)照組增高（P＜0.01），姜黃素干預(yù)組較模型組降低（P＜0.01）；大鼠肝臟GSH水平模型組較對(duì)照組降低（P＜0.01），姜黃素干預(yù)組較模型組顯著增高（P＜0.01）。生化分析儀檢測(cè)肝功能指標(biāo)示：大鼠血清ALT、AST水平模型組較對(duì)照組增高（P＜0.01），姜黃素干預(yù)組較模型組降低（P＜0.01）。
　　3.Wes

11、ternblot結(jié)果顯示對(duì)照組大鼠Nrf2核轉(zhuǎn)位及HO-1表達(dá)較少，模型組其表達(dá)較對(duì)照組增加，姜黃素干預(yù)組Nrf2核轉(zhuǎn)位及HO-1表達(dá)較對(duì)照組及模型組均明顯增加；大鼠肝臟中p-JNK表達(dá)水平模型組較對(duì)照組增加，姜黃素干預(yù)組較模型組減少；JNK表達(dá)水平各組間未見(jiàn)明顯變化；大鼠肝臟中p-IRS-1水平的表達(dá)模型組較對(duì)照組減少，姜黃素干預(yù)組較模型組增加；IRS-1表達(dá)水平各組間未見(jiàn)明顯變化。
　　4.人肝細(xì)胞LO2中ALT、AST及MD

12、A水平模型組均較對(duì)照組增高（P＜0.01），姜黃素干預(yù)組較模型組降低（P＜0.01），抑制劑組較干預(yù)組增高（P＜0.01）；GSH水平模型組較對(duì)照組降低（P＜0.01），姜黃素干預(yù)組較模型組增高（P＜0.01），抑制劑組較干預(yù)組降低（P＜0.01）。葡萄糖氧化酶-過(guò)氧化物酶方法檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)液中葡萄糖含量結(jié)果示：模型組較對(duì)照組增高（P＜0.01），姜黃素干預(yù)組較模型組降低（P＜0.01），抑制劑組較干預(yù)組增高（P＜0.01）。
　　

13、5.Westernblot結(jié)果顯示肝細(xì)胞Nrf2核轉(zhuǎn)位及HO-1的表達(dá)模型組較對(duì)照組輕度增加，姜黃素干預(yù)組較模型組明顯增加，抑制劑組較干預(yù)組減少；模型組肝細(xì)胞中p-JNK表達(dá)水平較對(duì)照組增加，姜黃素干預(yù)組較模型組減少，抑制劑組介于模型組和干預(yù)組之間；JNK表達(dá)水平各組間未見(jiàn)明顯變化；模型組肝細(xì)胞中p-IRS-1表達(dá)水平較對(duì)照組減少，姜黃素干預(yù)組較模型組增加，抑制劑組介于模型組和干預(yù)組之間；IRS-1表達(dá)水平各組間未見(jiàn)明顯變化。
　

14、　結(jié)論
　　本實(shí)驗(yàn)通過(guò)觀察Nrf2誘導(dǎo)劑姜黃素對(duì)高脂飲食誘導(dǎo)的大鼠IR模型的影響，發(fā)現(xiàn)誘導(dǎo)Nrf2核轉(zhuǎn)位能夠上調(diào)肝臟HO-1的表達(dá)，進(jìn)而改善高脂飲食引起的肝功損害、氧化應(yīng)激及IR。并利用肝細(xì)胞氧化應(yīng)激模型，通過(guò)誘導(dǎo)或阻斷Nrf2核轉(zhuǎn)位，發(fā)現(xiàn)阻斷Nrf2核轉(zhuǎn)位后，部分逆轉(zhuǎn)了誘導(dǎo)其核轉(zhuǎn)位時(shí)改善肝細(xì)胞功能及胰島素抵抗的效應(yīng)，證實(shí)誘導(dǎo)Nrf2/HO-1途徑能夠降低氧化應(yīng)激導(dǎo)致的IR，其效應(yīng)可能是通過(guò)降低JNK磷酸化水平、增加IRS-1磷酸