P25-CDK5-p53通路在BaP致神經(jīng)細(xì)胞凋亡中的作用研究.pdf

1、目的：利用大鼠原代培養(yǎng)皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞研究p25/CDK5-p53通路在BaP致神經(jīng)細(xì)胞凋亡中作用，探討B(tài)aP致神經(jīng)細(xì)胞凋亡的作用機制。
　　 方法：
　　 1.體外原代大鼠皮質(zhì)神經(jīng)元培養(yǎng):采用新生1-3天的SD大鼠，在無菌條件下取出大腦皮質(zhì)并用0.25％胰酶消化，以1000個/mm2接種神經(jīng)細(xì)胞。在神經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)第五天左右，選取生長良好的同批次細(xì)胞，以BaP同時加入S9染毒，染毒濃度分別為10、20、40μmol/L，并設(shè)空

2、白對照組、溶劑對照(DMSO)組和S9對照組，染毒后繼續(xù)培養(yǎng)觀察，分別于染毒0，6，12，24，48h后處理細(xì)胞。
　　 2.①顯微鏡觀察神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化，采用MTT法和流式細(xì)胞儀分別檢測神經(jīng)細(xì)胞活力和凋亡率;②單細(xì)胞瓊脂糖凝膠電泳和BPDE-DNA Adduct ELISA試劑盒檢測神經(jīng)細(xì)胞DNA損傷情況;③流式細(xì)胞儀檢測神經(jīng)細(xì)胞活性氧變化情況;④Western-blot法檢測神經(jīng)細(xì)胞p25/CDK5-p53通路相關(guān)蛋白ca

3、lpain、p35/25、CDK5、p53和p-p53Ser15表達;⑤抑制calpain活性和CDK5活性后，檢測上述相關(guān)指標(biāo)變化情況。⑥RT-PCR檢測calpain、p25、CDK5基因表達情況。
　　 結(jié)果：
　　 1.BaP染毒48h后，隨著染毒劑量的增加，神經(jīng)細(xì)胞活力呈下降趨勢，低、中、高劑量組神經(jīng)細(xì)胞活力分別下降了13.9％，19.0％，22.5％。隨著BaP染毒劑量的增加以及染毒時間的延長，神經(jīng)細(xì)胞數(shù)量減

4、少，胞體收縮，突觸變少變短，細(xì)胞間連接減少。AO-EB染色結(jié)果顯示，隨著BaP染毒劑量的增加以及染毒時間的延長，神經(jīng)細(xì)胞出現(xiàn)明顯的橘黃色凋亡細(xì)胞。析因設(shè)計方差分析結(jié)果顯示，隨著染毒時間的延長，不同濃度BaP組凋亡率增高;BaP染毒與神經(jīng)細(xì)胞凋亡率之間存在劑量和時間依賴性，且劑量與時間之間存在交互作用(P＜0.001)。在BaP染毒48h后，低、中、高劑量組與空白對照組相比神經(jīng)細(xì)胞凋亡率分別增加了0.66，1.90和2.14倍。
　

5、　 2.神經(jīng)細(xì)胞olive尾矩隨著BaP染毒時間的延長，濃度增加呈現(xiàn)上升趨勢;且BaP染毒與神經(jīng)細(xì)胞olive尾矩之間存在劑量和時間依賴性，劑量與時間之間存在交互作用(P＜0.001)。在BaP染毒48h后，低、中、高劑量組與空白對照組相比神經(jīng)細(xì)胞olive尾矩分別增加了0.33，0.77和1.68倍。神經(jīng)細(xì)胞BPDE-DNA加合物含量隨著BaP染毒時間的延長，不同濃度BaP組BPDE-DNA量增加;BaP染毒與神經(jīng)細(xì)胞BPDE-DN

6、A量之間存在劑量和時間依賴性，且劑量與時間之間存在交互作用(P＜0.001)。在BaP染毒48h后，低、中、高劑量組與空白對照組相比神經(jīng)細(xì)胞BPDE-DNA量分別增加了1.02，1.27和1.59倍。
　　 3.神經(jīng)細(xì)胞活性氧隨著染毒時間的延長、BaP濃度增加活性氧呈現(xiàn)上升趨勢;BaP染毒與神經(jīng)細(xì)胞活性氧之間存在劑量和時間依賴性，且劑量與時間之間存在交互作用(P＜0.001)。在BaP染毒48h后，低、中、高劑量組與空白對照組相

7、比神經(jīng)細(xì)胞活性氧分別增加了0.75，0.97和1.64倍。
　　 4.隨著染毒時間的延長，不同濃度BaP組神經(jīng)細(xì)胞α-spectrin、p35、p25、CDK5、p53、p-p53Ser15蛋白表達量增加;BaP染毒與神經(jīng)細(xì)胞α-spectrin、 p35、p25、CDK5、p53、p-p53Ser15蛋白表達量之間存在劑量和時間依賴性，且劑量與時間之間存在交互作用(P＜0.001)。在BaP染毒48h后，低、中、高劑量組與空白

8、對照組相比神經(jīng)細(xì)胞α-spectrin、p35、p25、CDK5、p53、p-p53Ser15蛋白表達量分別增加了1.71，1.95和2.40倍，0.94，1.19和1.69倍;0.91，2.00和3.03倍;1.40，1.78和3.10倍;0.45，0.51和0.73倍;1.25，1.36和1.96倍。
　　 5.MDL28170特異性抑制calpain活性后神經(jīng)細(xì)胞凋亡率有所下降;48h后低、中、高劑量組神經(jīng)細(xì)胞凋亡率分別降

9、低了47％，68％和71％。相應(yīng)的神經(jīng)細(xì)胞α-spectrin、p35、CDK5、p53、p-p53Ser15蛋白表達量下降;BaP作用48h后，低、中、高劑量組神經(jīng)細(xì)胞α-spectrin、p35、CDK5、p53、p-p53Ser15蛋白表達量分別降低了46％，47％和50％;42％，47％和48％;54％，57％和70％;29％，34％和37％;48％，45％和53％。
　　 6.Roscovitine特異性拮抗CDK5活

10、性后神經(jīng)細(xì)胞凋亡率呈下降趨勢;48h后低、中、高劑量組神經(jīng)細(xì)胞凋亡率分別降低了37％，42％和47％。相應(yīng)的神經(jīng)細(xì)胞CDK5、p53、p-p53Ser15蛋白表達量下降;BaP作用48h后，低、中、高劑量組神經(jīng)細(xì)胞CDK5、p53、p-p53Ser15蛋白表達量分別降低了37％，42％和60％;38％，30％和37％;53％，50％和58％。
　　 7.BaP染毒48h后，隨著染毒劑量的增加，神經(jīng)細(xì)胞calpain、p25、CD

11、K5基因表達呈上升趨勢，與空白對照組相比，高劑量組神經(jīng)細(xì)胞calpain、p35、CDK5基因表達量分別增加了8.02，2.96和1.94倍。
　　 結(jié)論：
　　 1.BaP可引起神經(jīng)細(xì)胞DNA損傷和氧化應(yīng)激，且BaP染毒與神經(jīng)細(xì)胞DNA損傷及氧化應(yīng)激之間存在劑量效應(yīng)和時間效應(yīng)關(guān)系;
　　 2.BaP可引起神經(jīng)細(xì)胞凋亡，且BaP染毒與神經(jīng)細(xì)胞凋亡之間存在劑量效應(yīng)和時間效應(yīng)關(guān)系;且從時間序列上可以看出，BaP可能通