自噬途徑在斑馬魚神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育及神經(jīng)變性疾病中的作用.pdf

1、自噬機(jī)制是近年來發(fā)現(xiàn)的繼凋亡之后細(xì)胞程序性死亡的新機(jī)制。自噬機(jī)制與胚胎發(fā)育、個(gè)體生長(zhǎng)、代謝和死亡等生命歷程密切相關(guān)，自噬的主要功能為降解細(xì)胞長(zhǎng)壽命蛋白和異常聚集蛋白。神經(jīng)元內(nèi)蛋白多為長(zhǎng)壽命蛋白質(zhì)，降解需要自噬途徑參與，但自噬基因與胚胎神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育的關(guān)系仍不清楚。此外，神經(jīng)變性疾病多是以變性蛋白異常聚集為特征，如帕金森病病理機(jī)制是α-synuclein、PINK1等蛋白異常聚集形成Lewy小體。很多綜述文獻(xiàn)報(bào)道自噬途徑與帕金森等神經(jīng)變性疾

2、病有重要聯(lián)系，自噬途徑受阻引起蛋白不能降解而異常聚集，進(jìn)而誘發(fā)各種神經(jīng)變性疾病。也有文獻(xiàn)報(bào)道促進(jìn)自噬途徑可能改善神經(jīng)變性疾病癥狀。但這些報(bào)道多數(shù)為綜述性文獻(xiàn)，自噬途徑在神經(jīng)退行性疾病中的作用機(jī)制也仍不清楚。本研究以斑馬魚為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，在基因/蛋白水平、細(xì)胞水平和表型/個(gè)體行為三個(gè)層次分別研究了自噬基因atg5及相關(guān)基因在胚胎神經(jīng)發(fā)育中的作用和在MPTP誘導(dǎo)的帕金森樣神經(jīng)退行性病變中的作用，探討了雷帕霉素與MPTP的相互作用及對(duì)atg5基因

3、活性的影響。主要研究結(jié)果如下：
　　 一、自噬基因atg5在斑馬魚胚神經(jīng)發(fā)育中具有重要的調(diào)控作用
　　 通過自噬基因atg5的時(shí)空表達(dá)規(guī)律和基因功能分析，發(fā)現(xiàn)atg5基因的表達(dá)水平伴隨著胚神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)生和發(fā)育的變化而變化；通過下調(diào)或上調(diào)atg5基因的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)atg5是腦區(qū)和軀干形態(tài)發(fā)生過程的必需因子，同時(shí)atg5也可以調(diào)控神經(jīng)元marker基因gli1，huC，nkx2.2，pink1，β-synuclein，xb

4、51和zicⅠ表達(dá)。研究進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)atg5是斑馬魚自噬途徑中的一個(gè)關(guān)鍵基因，可以調(diào)控其他自噬基因atg3、beclin1等的轉(zhuǎn)錄，并影響自噬標(biāo)識(shí)LC3-Ⅱ/LC3I比值的變化。此外，一個(gè)重要發(fā)現(xiàn)是ATG5蛋白可能通過一種反饋抑制環(huán)的方式調(diào)控自身基因的轉(zhuǎn)錄。同時(shí)發(fā)現(xiàn)另一個(gè)自噬基因atg12可能是一個(gè)看家基因，且一直處于恒定的高水平表達(dá)，提示ATG5-ATG12泛素結(jié)合系統(tǒng)的形成可能主要依賴ATG5蛋白水平調(diào)節(jié)，而非依賴ATG12蛋白。綜上

5、，atg5基因及自噬途徑參與調(diào)控了斑馬魚神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)生和器官發(fā)育。
　　 二、自噬途徑在MPTP誘導(dǎo)/RAPA抑制的斑馬魚帕金森樣模型中的作用
　　 采用可導(dǎo)致人帕金森疾病的化合物MPTP和自噬誘導(dǎo)劑雷帕霉素(rapamycin，RAPA)分別或共同作用于斑馬魚胚胎/幼體，研究自噬途徑在以帕金森病為代表的神經(jīng)變性疾病中的作用。
　　 首先根據(jù)MPTP誘導(dǎo)的斑馬魚幼體神經(jīng)胚發(fā)育畸形、導(dǎo)致中后腦神經(jīng)元細(xì)胞丟失、行為學(xué)

6、缺陷、多巴胺神經(jīng)元標(biāo)志基因th轉(zhuǎn)錄水平的下調(diào)等指標(biāo)初步建立了斑馬魚幼魚帕金森模型。通過基因表達(dá)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)MPTP能導(dǎo)致斑馬魚和入神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞atg5表達(dá)水平下調(diào)，推測(cè)可能部分阻斷自噬通路。而自噬促進(jìn)劑RAPA可以導(dǎo)致斑馬魚幼體處于興奮狀態(tài)，誘導(dǎo)atg5、beclin1等自噬基因表達(dá)上調(diào)，同時(shí)影響神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育基因huC、xb51、zic1、β-synuclein轉(zhuǎn)錄水平，提示RAPA可作用于神經(jīng)系統(tǒng)。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)RAPA對(duì)MPTP導(dǎo)致

7、的帕金森模型的神經(jīng)毒性具有挽救作用，但這種挽救作用是暫時(shí)的，兩者主要作用為協(xié)同毒性：表現(xiàn)為高劑量的兩種化合物共同作用于斑馬魚胚胎，畸形更加嚴(yán)重、死亡率／畸形率大于同劑量的兩種化合物單獨(dú)作用之和。本研究進(jìn)一步對(duì)這種挽救作用和協(xié)同毒性機(jī)制進(jìn)行了初步探討，發(fā)現(xiàn)RAPA和MPTP具有許多共同的靶蛋白，誘導(dǎo)或者抑制蛋白的作用多數(shù)一致，這可能是導(dǎo)致協(xié)同作用的原因；但MPTP可抑制一種34.4kD蛋白的表達(dá)，RAPA則與之相反，推測(cè)這可能是RAPA能