AGGF1在斑馬魚(yú)胚胎血管發(fā)育中的關(guān)鍵作用及機(jī)制研究.pdf

1、多于70余種疾病與血管發(fā)育異常有關(guān)。以血管發(fā)育為治療靶點(diǎn),包括抗抑制血管和促血管治療等已經(jīng)成為諸如癌癥、心血管疾病和黃斑退化等常見(jiàn)疾病的新興治療手段。然而,我們對(duì)于血管發(fā)育的過(guò)程以及其分子調(diào)控機(jī)制了解還不完全。動(dòng)脈和靜脈血管是血管系統(tǒng)發(fā)育過(guò)程中最早形成的重要部分,它們對(duì)于胚胎和成體都具有重要的作用,但它們之間在結(jié)構(gòu)和功能上卻又不盡相同。動(dòng)脈血管形成過(guò)程中,血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子-A(VEGF-A)通過(guò)Notch信號(hào)通路調(diào)控動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞的分

2、化。研究也發(fā)現(xiàn)了調(diào)控靜脈血管分化的因子,但對(duì)于其分子作用機(jī)制還了解的不是十分的清楚。AKT信號(hào)分子被發(fā)現(xiàn)通過(guò)抑制Raf-MEK1/2-ERK1/2信號(hào)對(duì)于靜脈血管的分化起重要作用。轉(zhuǎn)錄因子COUP-TFII也調(diào)控靜脈血管的發(fā)育,但與AKT的關(guān)系還未確定。與迄今為止,還沒(méi)有研究發(fā)現(xiàn)調(diào)控靜脈內(nèi)皮細(xì)胞分化的血管生成因子。
　　Klippel-Trenaunay綜合征(KTS)是一種先天性血管疾病,主要病癥表現(xiàn)為毛細(xì)血管畸形、靜脈血管畸形

3、、靜脈曲張并伴隨有患病組織肥大。雖然已有KTS遺傳家系報(bào)道,但大多數(shù)的KTS患者還多為偶發(fā)病例。研究證實(shí)KTS患者中出現(xiàn)諸如染色體易位以及18號(hào)染色體超數(shù)環(huán)等染色體突變,說(shuō)明遺傳因素是KTS重要致病原因。前期通過(guò)對(duì)KTS患者研究發(fā)現(xiàn),在5號(hào)和11號(hào)染色體上出現(xiàn)了易位,從而發(fā)現(xiàn)了一個(gè)新的血管生成因子AngiogenicfactorwithGpatchandFHAdomains1(AGGF1)。
　　人類(lèi)AGGF1定位于5q13.3,

4、其所編碼的蛋白質(zhì)在N端有coiled-coil和OCRE結(jié)構(gòu)域,C端具有forkhead-associateddomain(FHA)和G-patch結(jié)構(gòu)域,但這些結(jié)構(gòu)域的功能還未了解的十分清楚。AGGF1可以分泌到內(nèi)皮細(xì)胞外,純化的AGGF1蛋白可以促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞管的形成。在雞胚絨毛尿囊膜實(shí)驗(yàn)中,AGGF1可以促進(jìn)血管生成,并且在缺氧的情況下,AGGF1的表達(dá)升高。最近的研究發(fā)現(xiàn),AGGF1的轉(zhuǎn)錄水平受到轉(zhuǎn)錄因子GATA1調(diào)控。GATA1

5、特異siRNA可以降低AGGF1的表達(dá),導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞凋亡,阻礙內(nèi)皮細(xì)胞遷移和毛細(xì)血管形成。AGGF1在體內(nèi)是否與血管生成有關(guān);以及其調(diào)控血管生成的細(xì)胞信號(hào)通路與分子機(jī)制還完全未知。
　　本研究以斑馬魚(yú)為研究對(duì)象,通過(guò)干擾和過(guò)表達(dá)AGGF1等實(shí)驗(yàn)手段,研究該血管生成因子在胚胎發(fā)育過(guò)程中的生理學(xué)作用。主要結(jié)果如下:
　　AGGF1基因在斑馬魚(yú)發(fā)育早期就開(kāi)始表達(dá),在24hpf和48hpf階段其主要在腦部和中樞神經(jīng)細(xì)胞中表達(dá);而在成

6、魚(yú)的腦,眼,心臟等器官中也均有表達(dá)。
　　在Tg(kdrl:GFP)la116胚胎中注射AGGF1嗎啡啉寡核苷酸,體節(jié)間血管和腸下血管以及靜脈血管發(fā)育產(chǎn)生缺陷。
　　斑馬魚(yú)胚胎中過(guò)量表達(dá)AGGF1可以誘導(dǎo)血管生成,并增加靜脈血管直徑。AGGF1過(guò)量表達(dá)胚胎中,靜脈內(nèi)皮細(xì)胞特異表達(dá)基因flt4的表達(dá)量升高,動(dòng)脈特異表達(dá)標(biāo)志基因notch5表達(dá)基本未受影響。
　　整體原位雜交動(dòng)靜脈特異表達(dá)標(biāo)記基因結(jié)果顯示,在AGGF1敲降

7、胚胎中,動(dòng)脈血管發(fā)育正常,靜脈血管發(fā)育出現(xiàn)缺陷。AGGF1基因?qū)τ诎唏R魚(yú)胚胎發(fā)育過(guò)程中的動(dòng)-靜脈血管分化具有重要作用。AKT信號(hào)通路在靜脈血管發(fā)育過(guò)程中起重要作用。為探討AGGF1影響靜脈血管發(fā)育的分子機(jī)制,我們首先分析了AGGF1對(duì)AKT磷酸化水平的影響。Westernblot結(jié)果顯示:胚胎敲降了AGGF1后抑制AKT的活性,而注射AGGF1mRNA則會(huì)激活A(yù)KT的活性。通過(guò)AKTmRNA回補(bǔ)實(shí)驗(yàn),AKT的過(guò)量表達(dá)可以恢復(fù)AGGF1基