斑馬魚核糖核酸酶1和5在胚胎發(fā)育早期的功能研究.pdf

1、斑馬魚（zebrafish，Danio rerio）核糖核酸酶A超家族（RNase A superfamily）由Elio Pizzo等于2006年首次發(fā)現(xiàn)。迄今為止已報(bào)道的成員一共有5名，分別被命名為zebrafish RNase1/2/3/4/5(ZF-RNase-1/2/3/4/5)。作為人類血管生成素(humanangiogenin，hANG)的同源基因，它們與hANG在蛋白質(zhì)晶體結(jié)構(gòu)和細(xì)胞水平功能學(xué)方面有相當(dāng)高的相似程度?？紤]

2、到小鼠體內(nèi)存在6個(gè)hANG同源基因和3個(gè)假基因，進(jìn)行hANG功能學(xué)研究較為復(fù)雜，我們擬用斑馬魚作為體內(nèi)功能研究的動(dòng)物模型。為此，本文在初略探明斑馬魚胚胎發(fā)育早期ZF-RNases表達(dá)情況的基礎(chǔ)上，對(duì)2個(gè)在該時(shí)期顯著表達(dá)的成員----ZF-RNase-1和5進(jìn)行了深入研究，不僅構(gòu)建了兩者的時(shí)空表達(dá)模式，還探索了它們?cè)谠摃r(shí)期的體內(nèi)生物學(xué)功能。本研究主要內(nèi)容包括：
　　⑴從AB品系野生型斑馬魚整胚的cDNA中克隆得到ZF-RNases的

3、表達(dá)序列(expressed sequence tags，ESTs)，利用半定量PCR(semi-quantitative reversetranscription and PCR，semi-quantitative RT-PCR)的方法明確了5名成員中僅ZF-RNase-1/3/5在斑馬魚胚胎發(fā)育早期顯著表達(dá)。在此基礎(chǔ)上，我們利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(Real-time PCR，qRT-PCR)技術(shù)研究了ZF-RNase-1/3/5在受

4、精后0-72小時(shí)的時(shí)間表達(dá)譜。結(jié)果顯示，ZF-RNase-1在該時(shí)期的表達(dá)豐度極低，僅在受精后24小時(shí)被特異性上調(diào);ZF-RNase-3/5在該時(shí)期的表達(dá)水平隨時(shí)間逐漸上升，提示ZF-RNase-1/3/5在斑馬魚胚胎發(fā)育早期可能扮演不同角色，且ZF-RNase-1很可能僅參與調(diào)控受精后24小時(shí)這一時(shí)間點(diǎn)的特定發(fā)育學(xué)過程。鑒于已報(bào)道的ZF-RNase-3在蛋白質(zhì)晶體結(jié)構(gòu)和體外功能方面與hANG差異比較明顯，而在我們的初步探索中亦未發(fā)現(xiàn)其

5、明顯的體內(nèi)功能（詳見討論6.1），我們將研究重點(diǎn)集中到ZF-RNase-1和5上。
　?、圃浑s交（in situ hybridization）結(jié)果顯示，ZF-RNase-1 mRNA主要分布于原初腦和軀干腹側(cè);ZF-RNase-5 mRNA除了分布于以上組織區(qū)域外，還分布于卵黃囊四周。已知在斑馬魚胚胎發(fā)育早期，軀干腹側(cè)是主要血管——背主動(dòng)脈(dorsalaorta，DA)和后主靜脈(posterior cardinal vein

6、，PCV)所在的位置。因此，我們的結(jié)果明顯提示這兩個(gè)ANG同源基因可能參與對(duì)斑馬魚血管系統(tǒng)發(fā)育的調(diào)控，而ZF-RNase-5還可能與卵黃組織的形成或功能息息相關(guān)。為深入研究其功能，我們利用RACE(rapid-amplification of cDNA ends)技術(shù)獲得了ZF-RNase-1/5的全長cDNA。測(cè)序結(jié)果顯示，相比于NCBI數(shù)據(jù)庫中的對(duì)應(yīng)序列，本論文得到的ZF-RNase-1的cDNA缺失了整段信號(hào)肽序列，而ZF-RNa

7、se-5 cDNA的5'UTR不僅在-1至-104位的序列一致性僅為46％，還在-104位之前多出約170個(gè)堿基，提示雖然ZF-RNase-1被歸為斑馬魚核糖核酸酶A超家族，但它可能并非作為傳統(tǒng)認(rèn)為的分泌蛋白來發(fā)揮作用。
　?、抢媚茉诎唏R魚胚胎中特異性下調(diào)特定基因表達(dá)的常用工具——Morpholinos(Morpholino phosphorodiamidate antisense oligonucleotides, MOs)下

8、調(diào)ZF-RNase-1/5的表達(dá)水平，期望通過對(duì)表達(dá)下調(diào)后的胚胎所表現(xiàn)出的缺陷表型研究，初步揭示它們?cè)谂咛グl(fā)育早期的不同階段、不同組織中所行使的功能。
　?、壤每蓪?shí)時(shí)觀察和研究斑馬魚血管新生的轉(zhuǎn)基因斑馬魚品系Tg(fli1∶EGFP)y1來探索ZF-RNase-1在胚胎發(fā)育早期血管新生中的功能。我們將特異性靶向ZF-RNase-1的MOs注射入該轉(zhuǎn)基因斑馬魚的單細(xì)胞期受精卵的卵黃中，觀察并記錄受精后2天以內(nèi)的血管新生情況。結(jié)果顯

9、示，ZF-RNase-1的MOs導(dǎo)致胚胎在受精后36小時(shí)表現(xiàn)顯著的體節(jié)間血管(intersegmental vessel，ISV)缺陷，即ISV未延伸至背側(cè)頂端并形成背側(cè)縱向吻合血管(dorsal longitudinal anastomoticvessel， DLAV);該表型能夠通過補(bǔ)入體外轉(zhuǎn)錄的ZF-RNase-1 mRNA部分挽救。當(dāng)我們僅注射ZF-RNase-1 mRNA進(jìn)行過表達(dá)時(shí)，胚胎表現(xiàn)出顯著的ISV異位生長現(xiàn)象，即IS

10、V延伸至水平肌隔之上、尚未至背側(cè)頂端即提前分支，但最終卻在背側(cè)頂端形成正常的DLAV。進(jìn)一步研究表明，ZF-RNase-1表達(dá)水平的改變導(dǎo)致了促血管新生的VEGF信號(hào)在血管內(nèi)皮細(xì)胞膜表面的受體分子----kdrl(kinase insertdomain receptor like，VEGFR2)表達(dá)水平的相應(yīng)變化，而對(duì)抑制血管異位生長的Notch信號(hào)的配體分子----delta like ligand4(dll4)的表達(dá)水平無顯著影響。

11、以上結(jié)果表明，ZF-RNase-1通過VEGF信號(hào)通路促進(jìn)了胚胎發(fā)育早期血管新生過程中ISV的生長。
　?、裳芯苛薢F-RNase-5在胚胎發(fā)育早期血管新生及其卵黃延伸體形成和形態(tài)維持上的作用。在Tg(fli1∶EGFP)y1轉(zhuǎn)基因斑馬魚中下調(diào)ZF-RNase-5的表達(dá)后，胚胎發(fā)育早期血管新生中的ISV萌芽受到抑制;該表型能夠通過補(bǔ)入體外轉(zhuǎn)錄的ZF-RNase-5 mRNA顯著挽救。此外，這些胚胎還表現(xiàn)出顯著的形態(tài)學(xué)特征----卵

12、黃延伸體的缺陷。卵黃延伸體是從胚胎靠近頭部的球形卵黃囊向尾部延伸而形成的圓柱形腹側(cè)組織，主要為發(fā)育早期的胚胎軀干部提供營養(yǎng)物質(zhì)。為更直接地研究上述卵黃延伸體的缺陷表型，我們將特異性靶向ZF-RNase-5的MOs注射入AB品系野生型斑馬魚單細(xì)胞期受精卵的卵黃中，導(dǎo)致在受精后2-5天胚胎的孵化率和存活率顯著降低，提示ZF-RNase-5對(duì)早期胚胎發(fā)育是重要和必要的。在受精后24小時(shí)，這些胚胎依然表現(xiàn)出嚴(yán)重的卵黃延伸體缺陷，即卵黃延伸體顯著

13、縮小甚至完全缺失;該表型亦能夠通過補(bǔ)入體外轉(zhuǎn)錄的ZF-RNase-5 mRNA部分挽救。進(jìn)一步，我們通過TUNEL實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)下調(diào)ZF-RNase-5的表達(dá)誘導(dǎo)了胚胎卵黃合胞體層中特異性的DNA損傷。以上結(jié)果提示，ZF-RNase-5在卵黃延伸體的形成、維持及軀干間的營養(yǎng)物質(zhì)運(yùn)輸和代謝扮演了關(guān)鍵性的角色。在檢測(cè)到抑制ZF-RNase-5的表達(dá)顯著上調(diào)胚胎體內(nèi)與DNA損傷及細(xì)胞凋亡密切相關(guān)的p53蛋白水平并激活下游基因p21和Bax表達(dá)的基礎(chǔ)

14、上，我們利用p53基因操作和tp53基因DNA結(jié)合域突變的轉(zhuǎn)基因斑馬魚tp53M214K進(jìn)行機(jī)制研究。結(jié)果顯示，當(dāng)共注射特異性靶向ZF-RNase-5和p53的MOs后，上述卵黃延伸體的缺陷被顯著地部分挽救;抑制tp53M214K中ZF-RNase-5的表達(dá)未引起上述卵黃延伸體的缺陷。以上結(jié)果表明，下調(diào)ZF-RNase-5的表達(dá)不僅抑制了胚胎發(fā)育早期血管新生中ISV的萌芽，而且顯著上調(diào)了p53的蛋白水平，激活了p53信號(hào)通路，誘導(dǎo)了該時(shí)

15、期卵黃合胞體層中特異性的DNA損傷，從而引起了嚴(yán)重的卵黃延伸體缺陷。
　?、试谌祟愄ケP發(fā)育過程中hANG不僅在蛻膜期的腺上皮細(xì)胞、母源血管細(xì)胞、巨噬細(xì)胞中顯著表達(dá)，還可由絨毛外滋養(yǎng)層細(xì)胞、絨毛滋養(yǎng)層(extravillous and villous cytotrophoblasts)細(xì)胞分泌。本論文結(jié)果證明ZF-RNase-5在卵黃組織（亦被稱為假胎盤，與人類胎盤的主要功能相似）中高表達(dá)并發(fā)揮了積極作用。因此，我們有理由推測(cè)hAN

16、G可能參與調(diào)控了人類胎盤正常形態(tài)或功能的維持。
　?、吮狙芯坎粌H構(gòu)建了hANG的同源基因----斑馬魚核糖核酸酶A超家族成員ZF-RNase-1和ZF-RNase-5在胚胎發(fā)育早期的時(shí)空表達(dá)譜，完成了其cDNA全長的測(cè)定，還初步揭示了它們?cè)谠摃r(shí)期的體內(nèi)生物學(xué)功能。其中，ZF-RNase-1通過VEGF信號(hào)通路促進(jìn)了血管新生中ISV的生長;ZF-RNase-5不僅與血管新生中的ISV萌芽相關(guān)，而且通過p53信號(hào)通路調(diào)控卵黃延伸體形態(tài)