肺炎衣原體核糖核酸酶H的功能研究.pdf

1、核糖核酸酶H(RNase H)能夠特異地水解RNA/DNA雜合雙鏈或DNA-RNA-DNA/DNA嵌合型底物中的RNA。根據(jù)氨基酸序列及空間結(jié)構(gòu)相似性，RNase H分為兩類，1型和2型。其中，1型RNase H包括細菌的RNase HI及真核生物的RNase H1；2型RNase H包括細菌RNase HII、RNase HIII、古細菌RNase HII和真核生物RNase H2。
　　RNase HII/H2廣泛存在于各種生

2、物體內(nèi)，但RNase HI/H1和HIII只存留在部分生物體內(nèi)。目前人們普遍接受的看法是，RNase HI/H1和HIII只能切割含有四個(或更多)核糖核苷酸的DNA-(rN)n-DNA/DNA雙鏈(n≥4)或 RNA/DNA雜合鏈底物，而RNase HII/H2不僅可以切這些底物，還能切割 DNA-rN1-DNA/DNA(rN1，單個核糖核苷酸)雙鏈。
　　基因組全序列分析表明，肺炎衣原體沒有RNase HI，只有兩個2型的RN

3、ase H：CpRNase HII和CpRNase HIII，分別由CP0654和CP0782(NCBI序列號)基因編碼。我們前期的體外生化研究證實純化后的CpRNase HII蛋白能切割DNA-rN1-DNA/DNA底物；而CpRNase HIII可以切RNA/DNA底物。本研究發(fā)現(xiàn)CpRNase HIII在錳離子(Mn2+)存在時也能切割DNA-rN1-DNA/DNA底物。這是RNase H領域中首次報道RNase HIII具有切割

4、DNA-rN1-DNA/DNA底物的能力。
　　體外生化實驗證實，兩種CpRNase H切割DNA-rN1-DNA/DNA底物時對金屬離子的依賴性不同，CpRNase HIII依賴 Mn2+，而CpRNase HII則偏愛鎂離子(Mg2+)且活性會受到Mn2+抑制。進一步研究表明，在切割 DNA-rN1-DNA/DNA底物時，兩種酶對反應體系中的鎂錳離子波動敏感。另一方面，兩種CpRNase H切割其它底物(RNA/DNA雜合鏈及

5、類似岡崎片段的底物)時酶活性并不會因為鎂錳離子波動受到明顯影響。這些結(jié)果表明鎂錳離子水平的變化會抑制一種CpRNase H切割DNA-rN1-DNA/DNA底物的活性但同時激活另一種CpRNase H的活性。
　　在細菌體內(nèi)，我們也證實了上述體外實驗的結(jié)果。采用基因重組技術構(gòu)建了三株大腸桿菌rnh突變株，基因改造情況為：LZ1[DY329,ΔrnhAΔrnhB:: CprnhB], LZ2[DY329,ΔrnhA:: CprnhC

6、ΔrnhB::CprnhB]，LZ3[DY329,ΔrnhA:: CprnhCΔrnhB]。其中，CprnhB和CprnhC分別代表兩種CpRNase H(HII和HIII)的編碼基因；rnhA和rnhB分別表示大腸桿菌RNase HI和HII的編碼基因。CpRNase HII遺傳互補大腸桿菌 RNase H缺失依賴于Mg2+，但培養(yǎng)基中添加0.2 mM Mn2+抑制了CpRNase HII的該功能，導致細菌生長緩慢；相反，CpRNas

7、e HIII彌補大腸桿菌RNase H缺失則依賴于Mn2+。對大腸桿菌突變株的基因組進行堿敏感性分析發(fā)現(xiàn)，當CpRNase H活性受到抑制而導致細菌生長遲緩時，其基因組對堿非常敏感，表明此時基因組中摻入了大量核糖核苷酸。考慮到體外實驗證實CpRNase H酶切RNA/DNA雜合鏈、類似岡崎片段的底物時不受緩沖液中鎂錳離子波動的影響，突變株生長遲緩的主因是體內(nèi)CpRNase H切割DNA-rN1-DNA/DNA底物的活性受到抑制，導致基因

8、組中摻入了過多的單個核糖核苷酸；而在生長培養(yǎng)基內(nèi)添加對應喜好的金屬離子則會恢復CpRNase H的活性從而使突變株恢復正常生長。
　　培養(yǎng)基內(nèi)添加錳離子影響了細菌體內(nèi)CpRNase H的活性，這個結(jié)果暗示培養(yǎng)基內(nèi)添加錳時細菌胞內(nèi)的錳濃度發(fā)生了變化，我們提供了相關數(shù)據(jù)證實這一點。采用含有或不含錳的培養(yǎng)基培養(yǎng)這三株大腸桿菌突變株，用等離子發(fā)射光譜(ICP-AES)測定細菌胞內(nèi)錳離子濃度。結(jié)果表明含錳培養(yǎng)基培養(yǎng)的細菌相比不含錳培養(yǎng)基培養(yǎng)

9、的，其胞內(nèi)錳離子濃度增加了5~14倍，對胞內(nèi)RNase H活性產(chǎn)生了明顯影響，即促進CpRNase HIII活性、抑制CpRNase HII活性。另外，為了驗證培養(yǎng)基中添加的錳是否會影響CpRNase H編碼基因的表達，我們選擇在有錳和無錳時生長有差異的突變株并提取其總RNA進行實時定量PCR。采用管家基因gapA作為內(nèi)參基因做相對定量分析，結(jié)果證實基因表達并未因培養(yǎng)基中添加或缺少錳而有明顯差異，表明培養(yǎng)基中的錳影響突變株生長是因為Cp

10、RNase H的活性受到抑制，而不是CpRNase H編碼基因的表達受阻。
　　這些實驗結(jié)果表明，兩種CpRNase H在體內(nèi)是合作互助的關系：在正常情況下由CpRNase HII執(zhí)行功能，去除基因組中摻入的單個核糖核苷酸；而在離子波動的情況下，比如錳含量較高時，CpRNase HII的活性受到抑制而由CpRNase HIII行使同樣的功能。肺炎衣原體采用了兩種2型RNase H很可能是因為自身生存環(huán)境復雜，在復雜多變的外界環(huán)境中

11、兩種CpRNase H能夠合作、互補，從而使細胞可以維持正常生理代謝。
　　在證實CpRNase HIII也具有酶切DNA-rN1-DNA/DNA底物的活性之后，我們進一步研究了CpRNase HIII識別、切割這類底物的結(jié)構(gòu)基礎。通過體外生化測活，鑒定突變的氨基酸對該蛋白切割、識別底物的重要性；結(jié)合同源模建、分子對接及分子動力學模擬等計算機輔助的方法，闡明了CpRNase HIII識別DNA-rN1-DNA/DNA底物的機制。C

12、pRNase HIII的“GKG”基序負責識別單個核糖核苷酸，識別方式與RNase HII中“GR(K) G”基序相似，表明CpRNase HIII采納了與HII相似的底物識別機制。RNase HII/H2識別核糖核苷酸還需要一個高度保守的酪氨酸(Y)，但通過分析氨基酸序列及同源模建得到的蛋白結(jié)構(gòu)模型，發(fā)現(xiàn)在CpRNase HIII對應位置上沒有這樣一個Y殘基，通過分子動力學模擬我們發(fā)現(xiàn)CpRNase HIII的第94位的絲氨酸(Ser

13、94)與DNA-rN1-DNA/DNA底物中嵌合的單個核糖核苷酸3′-端的脫氧核糖核苷酸形成穩(wěn)定氫鍵，將該脫氧核糖核苷酸拖拽地偏離了核糖核苷酸，同時使DNA雙螺旋的局部構(gòu)象發(fā)生了變動。這個舉動似乎執(zhí)行了RNase HII中酪氨酸的功能，援助“GKG”基序準確地識別核糖核苷酸的2′-OH。在分子模擬結(jié)果的指導下，我們圍繞Ser94進行了一系列生化實驗，證明了該Ser對酶活性的重要性。這部分研究結(jié)果闡釋了CpRNase HIII的底物識別機