蚯蚓體腔液及脫氧核糖核酸酶的抗菌機(jī)制研究.pdf

1、目的: 制備蚯蚓體腔液粗提物，檢測(cè)粗提物的抗菌活性，確定其最低抑菌濃度和最低殺菌濃度。針對(duì)細(xì)菌結(jié)構(gòu)逐步研究蚯蚓體腔液的抗菌作用機(jī)制。確立蚯蚓脫氧核糖核酸酶(deoxyribonuclease，DNase)在蚯蚓固有免疫中的地位，分析蚯蚓DNase對(duì)細(xì)菌的作用。 方法: 蚯蚓體腔液通過碳酸銨處理、丙酮沉淀等一系列步驟制備出體腔液粗提物。用液體培養(yǎng)基二倍稀釋法測(cè)定蚯蚓體腔液粗提物最低抑菌濃度，再將無細(xì)菌生長(zhǎng)的各培養(yǎng)管

2、中的培養(yǎng)液分別移種在新鮮的瓊脂糖平板上，測(cè)定最低殺菌濃度。 通過檢測(cè)疏水性熒光探針1-N-pbenyl-naphtylamine(NPN)的熒光強(qiáng)度來測(cè)定體腔液對(duì)革蘭氏陰性菌外膜的穿透作用。比濁法測(cè)定體腔液對(duì)肽聚糖的分解作用。用分光光度計(jì)監(jiān)測(cè)鄰硝基苯酚(ortho-nitrophenol，ONP)的生成，以測(cè)定體腔液對(duì)細(xì)菌內(nèi)膜的透化作用。CATB法提取細(xì)菌基因組DNA，瓊脂糖凝膠電泳觀察體腔液降解細(xì)菌基因組DNA的活性。用堿裂解

3、法從產(chǎn)ESBL酶肺炎克雷伯菌中提取耐藥質(zhì)粒。瓊脂糖凝膠電泳觀察體腔液降解細(xì)菌耐藥質(zhì)粒DNA的活性。 用量化細(xì)菌生物膜的標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)蚯蚓DNase對(duì)生物膜的作用。分析蚯蚓DNase對(duì)體腔液的抗菌有無協(xié)同作用。 結(jié)果: 蚯蚓體腔液有明確的抗菌活性。細(xì)菌誘導(dǎo)的體腔液的抗菌活性顯著高于沒有細(xì)菌誘導(dǎo)的體腔液。在一定時(shí)間范圍內(nèi)，體腔液對(duì)細(xì)菌外膜、內(nèi)膜有時(shí)間依賴性穿透作用。體腔液能降解細(xì)胞壁中肽聚糖骨架，分解耐藥質(zhì)粒DNA、細(xì)

4、菌基因組DNA。蚯蚓DNase在檢測(cè)的各時(shí)間點(diǎn)均抑制細(xì)菌生物膜的形成，對(duì)體腔液有協(xié)同抗菌作用。 結(jié)論: 蚯蚓體腔液對(duì)細(xì)菌有殺滅效應(yīng)，但對(duì)各菌株作用有差異，說明體腔液的抗菌作用有選擇性。 蚯蚓體腔液的抗菌機(jī)制是通過對(duì)生物膜降解，透化細(xì)菌的外膜、內(nèi)膜，降解細(xì)胞壁中肽聚糖成分，使細(xì)菌通透性增高，細(xì)菌內(nèi)外物質(zhì)失去平衡，推測(cè)蚯蚓DNase透過孔道進(jìn)入胞漿降解遺傳物質(zhì)，造成細(xì)菌的徹底死亡。 蚯蚓DNase是固有免疫中