重組人核糖核酸酶抑制因子的復(fù)性及純化.pdf

1、該實驗室從人胎盤中和豬肝中提取的RI,給予荷瘤小鼠后可以抑制乳腺癌實體瘤Ca761,肉瘤S180,肝癌實體瘤H22的生長.并通過實驗證實惡性腫瘤患者工細(xì)胞中RI活性下降,瘤組織內(nèi)的基因表達下降.因為RI在腫瘤治療中有較好的應(yīng)用前景,并且RI從組織中提取的產(chǎn)量較少,成本高,不適宜大批量生產(chǎn),所以該室一直研究其基因工程生產(chǎn)的方法.但是重組的RI在大腸桿菌中的表達后是以包含體的形式存在.包涵體是重組蛋白的菌體內(nèi)過表達后形成的聚集體,但是其所含

2、的重組蛋白沒有生物學(xué)活性.這個問題一直困擾著我們,使我們的工作停步不前.該文主要研究了包含體的復(fù)性及純化,為此作了以下的一些工作:1.hRI在E.coli中的表達:用小量堿裂解法提取重組質(zhì)粒pET23b-ri并用氯化鈣法轉(zhuǎn)化表達菌BL21(DE3).將BL21(DE3)置于含有氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中擴增至A<,600>=0.6后加入誘導(dǎo)劑IPTG,誘導(dǎo)hRI的表達.2.包涵體的純化和溶解:超聲破碎細(xì)菌后,離心取沉淀,即包涵體.用含有去

3、垢劑和緩沖液反復(fù)洗滌包涵體,以除去脂類、膜蛋白、黏附在其上的蛋白質(zhì).最后用含有8M的尿素和20mmol/Lβ-巰基乙醇的緩沖液將包涵體溶解.3.包涵體復(fù)性:該文采用三種復(fù)性方法,分別是稀釋法、凝膠過濾層析法、透析法.4.親和柱層析純化:使用的配基為RNaseA.用緩沖液平衡親和柱CNBr活化的Sepharose4B,直至檢測基線平穩(wěn).取復(fù)性后的樣品上樣.用緩沖液洗柱子,去除未結(jié)合的雜蛋白,直至基線穩(wěn)定.用洗脫緩沖液洗脫柱子,收集目標(biāo)蛋白