人核糖核酸酶抑制因子干涉載體的構(gòu)建及其對腫瘤細(xì)胞生長的影響.pdf

1、腫瘤一直是威脅人類健康和生命的嚴(yán)重疾病之一，因而全世界醫(yī)學(xué)界都在破解腫瘤發(fā)生的原因及尋找替代傳統(tǒng)的手術(shù)、放、化療的新方法、新機制。近年來研究認(rèn)為，腫瘤是癌基因激活、抑癌基因缺失或失活造成的。人體內(nèi)存在抑制腫瘤系統(tǒng)。在這個系統(tǒng)中有多個調(diào)節(jié)因子參與。當(dāng)這些抑制因子發(fā)生缺失或失活時則導(dǎo)致細(xì)胞生長、增殖、分裂失調(diào)，進(jìn)而會導(dǎo)致細(xì)胞癌變。 人核糖核酸酶抑制因子(Human ribonuclease inhibitor，hRI)是體內(nèi)重要的蛋

2、白質(zhì)。功能是多方面的。其基因定位15p<'15.5>,分子量約為50kD，在哺乳動物細(xì)胞質(zhì)內(nèi)廣泛存在。hRI一級結(jié)構(gòu)富含亮氨酸和大量還原型半胱氨酸，空間結(jié)構(gòu)由富含亮氨酸殘基重復(fù)區(qū)(Leucin-richreapeat，LRR)的a/β螺旋折疊結(jié)構(gòu)重復(fù)多次形成的彎曲的馬蹄形結(jié)構(gòu)。國內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)，在正常細(xì)胞內(nèi)，hRI通過作為RNase A抑制劑(Ki=4.0×10<'-14>M)，從而調(diào)控細(xì)胞內(nèi)RNA的水平；hRI還可以作為血管生長因子(A

3、ngiogenin，Ang)抑制劑(Ki=7.1×10<'16>M)而抑制腫瘤血管形成、浸潤及轉(zhuǎn)移等作用；hRI還具有抗機體氧化損傷功能。綜合國內(nèi)外的研究，本課題組認(rèn)為hRI具有抗腫瘤作用，推測其可能為腫瘤抑制基因的候選者之一。 為了亞明hRI是否是腫瘤抑制因子，我們構(gòu)建了針對hri基因的siRNA 表達(dá)載體 pKD-dsRI，及該 siRNA 的穩(wěn)定表達(dá)載體pLNCX-pKD-dsRI。同時構(gòu)建了過表達(dá)hri的攜帶有綠色熒光蛋

4、白的表達(dá)載體(pEGFP．C<,1>-hri)及逆轉(zhuǎn)錄病毒表達(dá)載體(pLNCX-EGFP-C<,1>-hri)。將這些重組質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染到小鼠黑色素瘤細(xì)胞B16細(xì)胞中，用細(xì)胞熒光定位法檢測共轉(zhuǎn)染的報告基因．綠色熒光蛋白(hri基因的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體pLNCX-EGFP-C<,1>-hri)的熒光表達(dá)程度。結(jié)果表明，檢測到干擾效果可達(dá)80﹪以上。用RT-PCR半定量分析顯示，干擾效果可達(dá)80﹪以上。 westen-blotting分析

5、表明， RI表達(dá)明顯下調(diào)。我們用載體pLNCX-pKD-dsRI對B16細(xì)胞中的hri基因表達(dá)干擾后，用MTT檢測細(xì)胞生長增殖能力，結(jié)果發(fā)現(xiàn)細(xì)胞生長能力顯著增加，增殖率是對照 B16細(xì)胞的120﹪-145﹪(P<0.05)；流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期時相，結(jié)果是細(xì)胞周期發(fā)生明顯改變，S期增加，G2/M期減少。說明pLNCX-pKD-dsRI轉(zhuǎn)染組的B16細(xì)胞增殖加快。初步證明人核糖核酸酶抑制因子屬于一種腫瘤抑制因子。我們的研究首次通過RNA