血細(xì)胞核糖核酸酶抑制因子基因突變分析的方法建立及對宮頸癌患者的檢測.pdf

1、本實(shí)驗(yàn)首先采用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)的方法用正常對照組的血液標(biāo)本提取出的基因組DNA為模板，進(jìn)行實(shí)驗(yàn)條件的優(yōu)化，其次將正常對照組與宮頸癌患者組血液標(biāo)本提取出的基因組DNA為模板，分別擴(kuò)增出以上21對引物所對應(yīng)的目的片段。 為了驗(yàn)證PCR擴(kuò)增的效果，內(nèi)參采用β-actin。突變分析則利用單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析(singlestrandconformationpolymorphism，SSCP)的方法，亦使用正常對照組的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物來

2、進(jìn)行實(shí)驗(yàn)條件的摸索，根據(jù)PCR所擴(kuò)增出的目的片段熱變性后在聚丙烯酰胺凝膠電泳中的單鏈遷移率的差異來判斷突變是否發(fā)生。本實(shí)驗(yàn)對PCR的實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行優(yōu)化后，設(shè)計(jì)的21對引物所對應(yīng)的目的片段全部擴(kuò)出。實(shí)驗(yàn)在PCR擴(kuò)增后將目的片段用于普通瓊脂糖凝膠電泳時(shí)，將正常對照組和宮頸癌患者組都擴(kuò)增出的相應(yīng)片段按照引物的不同分成21組進(jìn)行比較，均未發(fā)現(xiàn)DNA條帶在遷移率上有差異。在經(jīng)過SSCP分析實(shí)驗(yàn)的條件摸索后認(rèn)為本實(shí)驗(yàn)理想的實(shí)驗(yàn)條件是：聚丙烯酰胺凝膠的

3、交聯(lián)度(丙烯酰胺：甲叉雙丙烯酰胺)49：1，濃度4﹪不加甘油，厚度1mm，電壓200v，溫度4℃，緩沖液0.5×TBE，上樣量5μl。SSCP分析的分組與以上普通瓊脂糖凝膠電泳的分組相同，根據(jù)公式M=Ld/Vt計(jì)算遷移率，使用統(tǒng)計(jì)學(xué)的三因素方差分析檢驗(yàn)證明實(shí)驗(yàn)重復(fù)性良好。聚丙烯酰胺凝膠電泳結(jié)果亦未顯示在正常對照組與宮頸癌患者組的DNA單鏈遷移率上有差異。 本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果顯示宮頸癌患者的核糖核酸酶抑制因子基因與正常人的核糖核酸酶抑制