逆轉(zhuǎn)錄病毒介導(dǎo)的人核糖核酸酶抑制因子對(duì)小鼠黑色素瘤基因治療的研究.pdf

1、大連醫(yī)科大學(xué)博士學(xué)位論文逆轉(zhuǎn)錄病毒介導(dǎo)的人核糖核酸酶抑制因子對(duì)小鼠黑色素瘤基因治療的研究姓名：傅攀峰申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別：博士專業(yè)：生物化學(xué)與分子生物學(xué)指導(dǎo)教師：崔秀云20030601干／祖細(xì)胞的豐富來(lái)源，具有早期祖細(xì)胞含量高，干／祖細(xì)胞體外增殖能力強(qiáng)和移植物抗宿主病發(fā)病率低等優(yōu)點(diǎn)，是基因治療理想的靶細(xì)胞；②自我更新能力強(qiáng)，利于基因長(zhǎng)期、穩(wěn)定的表達(dá)；③易于體外培養(yǎng)；④易于植回患者體內(nèi)并存活。關(guān)于Iu的抗腫瘤研究，我們實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)進(jìn)行了大量的工作。

2、我們從人胎盤(pán)中和豬肝中提取Iu，給予荷瘤小鼠后可以抑制乳腺癌實(shí)體瘤Ca761，肉瘤SlS0，肝癌實(shí)體瘤H22的生長(zhǎng)。并通過(guò)實(shí)驗(yàn)證實(shí)惡性腫瘤患者紅細(xì)胞中Iu活性下降，瘤組織內(nèi)ri基因表達(dá)下降。本研究的目的在于，應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄病毒載體系統(tǒng)，將人核糖核酸酶抑制因子基因轉(zhuǎn)移到小鼠骨髓造血細(xì)胞中，使其在骨髓細(xì)胞中得到高表達(dá)；進(jìn)而將表達(dá)Rj的骨髓細(xì)胞移植給經(jīng)y射線照射的小鼠，希望Iu基因在小鼠體內(nèi)長(zhǎng)期表達(dá)，從而可以通過(guò)抑制腫瘤的血管形成這一途徑抑制種植

3、在小鼠皮下黑色素瘤的生長(zhǎng)。同時(shí)本研究分析了逆轉(zhuǎn)錄病毒對(duì)小鼠造血細(xì)胞和人CD34的轉(zhuǎn)染效率及本轉(zhuǎn)染系統(tǒng)的安全性。為此做了以下的一些工作。1用脂質(zhì)體的方法將含有人核糖核酸酶抑制因子基因的重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體pLNCXri轉(zhuǎn)入逆轉(zhuǎn)錄病毒包裝細(xì)胞PA317中，經(jīng)G418篩選，得到陽(yáng)性克隆，進(jìn)而用小鼠成纖維細(xì)胞NIH3T3測(cè)定病毒滴度，分別得到滴度為6104CFU／ml的產(chǎn)空質(zhì)粒病毒細(xì)胞克隆和滴度為25105CFU／ml的產(chǎn)重組質(zhì)粒病毒的細(xì)胞克隆。

4、2輔助病毒分析表明，該轉(zhuǎn)染系統(tǒng)無(wú)輔助病毒的污染，用病毒感染后的NIH3T3細(xì)胞培養(yǎng)上清再培養(yǎng)NIH3T3細(xì)胞，無(wú)抗G418的抗性克隆產(chǎn)生，說(shuō)明該轉(zhuǎn)染系統(tǒng)是安全可靠的。3基因治療的關(guān)鍵和難點(diǎn)是轉(zhuǎn)染系統(tǒng)的轉(zhuǎn)染效率，本研究通過(guò)體外和體內(nèi)兩條途徑分析了逆轉(zhuǎn)錄病毒對(duì)小鼠骨髓造血細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率，同時(shí)也分析了逆轉(zhuǎn)錄病毒對(duì)人臍血CD34細(xì)胞的體外轉(zhuǎn)染效率。研究結(jié)果顯示，逆轉(zhuǎn)錄病毒對(duì)小鼠骨髓細(xì)胞的體外轉(zhuǎn)染效率為35％40％；將體外篩選后的骨髓細(xì)胞移植給小

5、鼠后，一個(gè)月后體內(nèi)的表達(dá)效率為70％。而逆轉(zhuǎn)錄病毒對(duì)人CD34細(xì)施的體外轉(zhuǎn)染效率為17％20％。4對(duì)進(jìn)行了骨髓移植的小鼠，檢測(cè)其骨髓、血液、脾臟、胸腺、肝臟中外源基因的表達(dá)情況用PCR和RTPCR均可以檢測(cè)到ri基因在上述組織中的存在，同時(shí)用Westemblot的方法檢測(cè)到RI在骨髓、脾臟、血液中均有表達(dá)。熒光免疫的方法檢測(cè)到Ⅺ在骨髓細(xì)胞和血液細(xì)胞中均有高表達(dá)。用ELISA的方法對(duì)血液中的Iu進(jìn)行了動(dòng)態(tài)的觀察，發(fā)現(xiàn)小鼠血中的lu在移植后