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文檔簡介
1、目的:構(gòu)建核糖核酸酶抑制因子(RI)基因siRNA干擾質(zhì)粒,并檢測其對人膀胱癌BIU-87細胞侵襲和轉(zhuǎn)移的影響。 方法:設(shè)計并構(gòu)建針對RI基因mRNA的2個特異性siRNA表達載體和1個無同源性的陰性對照載體,通過酶切和DNA測序鑒定載體,再轉(zhuǎn)染BIU-87細胞,通過RT-PCR、western blot和免疫細胞化學檢測干擾的有效性。觀察細胞形態(tài)改變,細胞粘附實驗、劃痕實驗和Transwell法測定細胞粘附、遷移和侵襲能力的變
2、化,分析細胞中基質(zhì)金屬基質(zhì)酶的表達,及用激光共聚焦顯微鏡觀察細胞骨架微絲結(jié)構(gòu)。 結(jié)果:酶切和測序鑒定質(zhì)粒構(gòu)建符合實驗設(shè)計;轉(zhuǎn)入特異性siRNA表達載體后RI蛋白的表達被顯著抑制,對照組未發(fā)生顯著改變;2個干擾實驗組的細胞形態(tài)堆疊嚴重,細胞粘附顯著降低,遷移和侵襲能力顯著增加,基質(zhì)金屬蛋白酶MMP-2和MMP-9顯著提高,細胞骨架微絲聚集,細胞伸展出片狀偽足。 結(jié)論:已成功構(gòu)建RI基因siRNA干擾質(zhì)粒,抑制RI基因的表達
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