巨大芽孢桿菌產(chǎn)胞外核糖核酸酶的分離純化及性質(zhì)和功能基團(tuán)研究.pdf

1、核糖核酸酶(Ribonuclease,Rnase)是一類廣泛存在于動(dòng)植物和微生物體內(nèi)的核酸水解酶,通過(guò)裂解磷酸二酯鍵分解核糖核酸。該酶參與RNA代謝、細(xì)胞成熟、細(xì)胞凋亡、血管生成以及宿主防御RNA病毒等過(guò)程。其作為模型蛋白常被用于分子生物學(xué)研究,作為重要的分析酶應(yīng)用于食品和藥物工業(yè),此外在商業(yè)上還被用于生產(chǎn)核苷酸和調(diào)味劑。其中來(lái)自微生物的Rnase有特殊的生物學(xué)功能,如具有抗病毒,抗真菌,抗惡性腫瘤細(xì)胞增生的活性。
　　 巨大芽

2、孢桿菌(Bacillusmegaterium)屬于芽孢桿菌(Bacillusspp.),在自然界中分布廣泛,具有遺傳穩(wěn)定、產(chǎn)物可分泌、發(fā)酵工藝簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn),多用于工業(yè)生產(chǎn)各種酶類如淀粉酶、青霉素酰胺酶和葡萄糖異構(gòu)酶等。通過(guò)實(shí)驗(yàn)證明巨大芽孢桿菌能高效表達(dá)Rnase,且發(fā)酵成分簡(jiǎn)單,雜蛋白相比動(dòng)植物材料更少,分離純化簡(jiǎn)單,有效降低目的蛋白獲取的成本,便于工業(yè)化生產(chǎn)。目前為止對(duì)于巨大芽孢桿菌Rnase的分離純化未見(jiàn)報(bào)道,本文分離純化了巨大芽孢桿

3、菌的Rnase,并對(duì)其進(jìn)行了性質(zhì)研究,以期為該酶的開(kāi)發(fā)及應(yīng)用莫定基礎(chǔ)。
　　 巨大芽孢桿菌發(fā)酵液經(jīng)硫酸銨沉淀、CM-Sepharose離子交換層析和Superdex-200凝膠過(guò)濾層析,純化得到核糖核酸酶電泳純品,純化倍數(shù)為606.67倍,酶活力回收率為11.37%,該酶比活力為54272.27U/mg。該酶分子量約為33.3kD,最適溫度為52.5℃,最適pH為8.5,在20～40℃以及pH6.0～7.0范圍內(nèi)穩(wěn)定性較好。以不

4、同濃度酵母RNA為底物在最適條件下測(cè)得該酶Km值為2630.02μg/mL。
　　 性質(zhì)研究表明:Fe2+、Cu2+、SDS、抗壞血酸和草酸對(duì)該酶活性有抑制作用。EDTA和Mg2+對(duì)Rnase活性幾乎不影響,KSCN與金屬離子Li+,K+,Mn2+,Ba2+,Co2+,Na+,Zn2+在低濃度下對(duì)Rnase有抑制作用,異丙醇、甲醇、乙醇和和乙腈這四種有機(jī)物對(duì)Rnase有輕微激活作用,其中異丙醇的激活作用最強(qiáng)。
　　 功能