生殖細(xì)胞特異性轉(zhuǎn)錄因子SOHLH1及其相關(guān)基因在卵巢發(fā)育中的作用.pdf

1、第一章探索Sohlh1下游轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子目的：Sohlh1是生殖細(xì)胞特異性轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，具有helix-loop-helix(HLH)結(jié)構(gòu)域，Sohlh1基因敲除雌鼠表現(xiàn)為卵細(xì)胞過(guò)早丟失，卵巢萎縮，成年Sohlh1基因敲除小鼠卵巢僅為正常小鼠卵巢的1/10大，最終以不孕為特點(diǎn)。HLH結(jié)構(gòu)與DNA啟動(dòng)子區(qū)域E-Box作用元件相結(jié)合調(diào)控其它基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，Sohlh1作為HLH家族一員，將其敲除，會(huì)導(dǎo)致一系列下游基因失調(diào)，從而引起卵巢早衰的表

2、現(xiàn)。本實(shí)驗(yàn)?zāi)康脑谟谔接慡ohlh1敲除小鼠卵巢的過(guò)早衰退的途徑及篩查Sohlh1的下游基因。 方法：通過(guò)對(duì)減數(shù)分裂影響因子及進(jìn)入減數(shù)分裂期卵細(xì)胞的染色體形態(tài)學(xué)分析，并應(yīng)用基因芯片技術(shù)，聯(lián)合比較Sohlh1缺陷新生小鼠卵巢與另外兩個(gè)生殖細(xì)胞特異因子-Lhx8和Nobox缺陷的新生小鼠卵巢芯片數(shù)據(jù)，分析Sohlh1基因敲除小鼠卵巢異常表型的原因、Sohlh1與Lhx8和Nobox的關(guān)聯(lián)作用，篩選下游靶基因。 結(jié)論：Sohlh

3、1基因敲除小鼠的卵巢早衰表現(xiàn)不是由于減數(shù)分裂異常所造成；通過(guò)基因芯片的應(yīng)用，我們找到了Sohlh1及其下游通路上的Lhx8、Nobox基因的共同調(diào)節(jié)的若干靶基因，對(duì)生殖細(xì)胞早期發(fā)育的調(diào)控通路作了進(jìn)一步的完善。 第二章Sohlh1轉(zhuǎn)基因小鼠 目的：Sohlh1作為生殖細(xì)胞特異性轉(zhuǎn)錄因子，在卵泡發(fā)育早期過(guò)程中起到了重要作用，其表達(dá)具有很強(qiáng)的特異性一僅在小鼠卵巢的卵原細(xì)胞、始基卵泡和初級(jí)卵泡中表達(dá)，而次級(jí)卵泡以后則無(wú)法檢測(cè)到。

4、我們猜想Sohlh1在高級(jí)卵泡中的缺失表達(dá)是卵泡后期發(fā)育的關(guān)鍵，如果過(guò)量表達(dá)可能會(huì)影響到卵細(xì)胞的成熟、排卵及受精方面的異常，于是在本章節(jié)的我們的研究目的是構(gòu)建在次級(jí)卵泡中表達(dá)Sohlh1的轉(zhuǎn)基因小鼠，并觀察評(píng)價(jià)該轉(zhuǎn)基因鼠的生殖生育能力。 方法：Zp3是另一個(gè)對(duì)卵泡發(fā)育和精卵結(jié)合起重要作用的卵細(xì)胞特異表達(dá)因子，在小鼠卵巢的各級(jí)卵泡中均有表達(dá)。據(jù)此，我們應(yīng)用小鼠Zp3啟動(dòng)子區(qū)域，將小鼠Sohlh1開放讀碼區(qū)即轉(zhuǎn)錄區(qū)銜接于mZp3啟動(dòng)

5、子之后，采用轉(zhuǎn)基因技術(shù)獲得Sohlh1轉(zhuǎn)基因小鼠。然后對(duì)此轉(zhuǎn)基因鼠進(jìn)行表型分析。 結(jié)論：我們成功構(gòu)建了Sohlh1于各級(jí)卵泡中持續(xù)表達(dá)的轉(zhuǎn)基因小鼠模型，Sohlh1并非卵細(xì)胞后期成熟的抑制因子，相反的，Sohlh1的過(guò)表達(dá)可以促進(jìn)排卵，或可用于動(dòng)物繁殖中某些基因型的優(yōu)化。 第三章生殖細(xì)胞特異性基因SOHLH1、FIGLA和CDF9在卵巢早衰發(fā)病機(jī)制中的作用研究 第一節(jié):美國(guó)高加索卵巢早衰患者SOHLH1基因突變篩

6、查 目的：Sohlh1是生殖細(xì)胞特異性轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，具有helix-loop-helix(HLH)結(jié)構(gòu)域，Sohlh1基因敲除雌鼠表現(xiàn)為始基卵泡向初級(jí)卵泡的發(fā)育障礙，卵細(xì)胞過(guò)早丟失，卵巢萎縮，不能生育。Sohlh1基因敲除小鼠的表現(xiàn)型極似人類卵巢早衰的疾病表現(xiàn)，于是推想人類SOHLH1基因突變可能與卵巢早衰發(fā)病有關(guān)。 方法：選擇96例美國(guó)高加索人種POF患者及同類人種對(duì)照96人，應(yīng)用PCR擴(kuò)增直接測(cè)序的方法，對(duì)SOHLH

7、1基因的7個(gè)外顯子包括5’端和3’端非翻譯區(qū)(UTR)及相應(yīng)側(cè)翼序列進(jìn)行突變篩查。 結(jié)論：c.423A＞G所致的K120R，在靈長(zhǎng)目動(dòng)物中屬于保守序列，可能會(huì)與POF的發(fā)病有一定關(guān)系；另外，3'UTR是microRNA的結(jié)合部位，SOHLH1基因3'UTR所出現(xiàn)的大量SNPs改變，很可能會(huì)影響到一系列microRNA的靶定結(jié)合，從麗致SOHLH1的表達(dá)失衡，這或可是導(dǎo)致卵細(xì)胞過(guò)早丟失的另一原因，有待于進(jìn)一步的研究。 第二

8、節(jié):中國(guó)漢族卵巢早衰患者FIGLA基因突變篩查 目的：卵巢早衰(POF)是引起高促性腺激素性不孕的一常見疾病，在女性人群中的發(fā)病率為1-2％。卵巢早衰的病因具有多樣性，部分原因仍考慮為單基因突變引起。 而FIGLA，是目前所知的最早調(diào)控卵細(xì)胞發(fā)育成熟的轉(zhuǎn)錄因子，F(xiàn)igla基因缺陷雌性小鼠卵巢中無(wú)法形成始基卵泡，亦無(wú)卵細(xì)胞透明帶形成，故推測(cè)FIGLA基因突變可能會(huì)關(guān)系至POF。 方法：選擇就診于我們生殖中心的100

9、例漢族POF婦女，及304例對(duì)照進(jìn)行血樣DNA提取，PCR特異擴(kuò)增包含有FIGLA的5個(gè)外顯子的區(qū)域，進(jìn)行直接測(cè)序(ABI PrismSequencer 3130XL Applied Biosystems)；后應(yīng)用酵母雙雜交實(shí)驗(yàn)證實(shí)其中一缺失突變影響FILGA與TCF3的結(jié)合。 結(jié)論：在中國(guó)漢族的POF人群中，有部分的發(fā)病與基因FIGLA突變有關(guān)。 第三節(jié):中國(guó)漢族卵巢早衰患者GDF9基因突變篩查 目的：卵巢早衰

10、(Premature Ovarian Failure，POF)是指青春期后、40歲以前發(fā)生的非生理性的月經(jīng)停止，伴有促卵泡素(FSH)、黃體生成素(LH)水平的升高、雌激素(E2)水平的下降以及臨床上表現(xiàn)的潮熱、不育和生殖器官的萎縮等綜合癥。而生長(zhǎng)分化因子9(GDF9)是由卵細(xì)胞分泌的，對(duì)卵泡發(fā)育起重要作用的生殖細(xì)胞生長(zhǎng)因子。本研究旨在探求基因GDF9突變是否與國(guó)人POF有關(guān)。 方法：收集2003年5月～2006年5月在山東大學(xué)

11、山東省立醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心就診的卵巢早衰患者100例，及有正常生育史和月經(jīng)史對(duì)照96人的外周血。其中卵巢早衰患者的采集符合如下標(biāo)準(zhǔn)：年齡在40歲以下，超過(guò)3個(gè)月經(jīng)周期無(wú)月經(jīng)來(lái)潮；至少兩次不同日血清FSH＞40 IU/L，陰道B超監(jiān)測(cè)雙側(cè)卵巢未見儲(chǔ)備卵泡，并除外染色體異常及免疫性疾病。提取外周血DNA，于GDF9編碼區(qū)設(shè)計(jì)3對(duì)特異性引物行PCR擴(kuò)增，先用變性高效液相色譜法(Denaturing High-Performance Liquid

12、 Chromatography，DHPLC)檢測(cè)是否存在雜合雙鏈。如果檢測(cè)出雜合雙鏈，再用PCR產(chǎn)物直接測(cè)序?qū)ふ彝蛔兾稽c(diǎn)。 結(jié)論：我們?cè)?00例POF患者中發(fā)現(xiàn)了6個(gè)位點(diǎn)的突變，其中4個(gè)為新發(fā)突變，2個(gè)為已知突變。新發(fā)現(xiàn)突變中兩個(gè)也同樣出現(xiàn)在對(duì)照組中，未出現(xiàn)在對(duì)照組中的一個(gè)(c.588A＞C)為同義突變，另一個(gè)c.712A＞G致丙氨酸錯(cuò)譯為蘇氨酸(p.Thr238Ala)，該位點(diǎn)屬于GDF9蛋白編碼功能保守區(qū)，推測(cè)此突變可能會(huì)影