SIM2-s基因在人腦膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中特異性表達(dá)及在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤侵襲中的作用.pdf

1、研究背景:
　　 人腦膠質(zhì)瘤是中樞系統(tǒng)最常見(jiàn)的原發(fā)性腫瘤,其中膠質(zhì)母細(xì)胞瘤(GlioblastomaMultiforme,GBM)約占50％。膠質(zhì)母細(xì)胞瘤是由星形膠質(zhì)細(xì)胞瘤惡性變而來(lái),是惡性程度最高的星形細(xì)胞瘤?；颊甙l(fā)病年齡多在45-70歲之間,臨床病史較短,預(yù)后差,平均生存時(shí)間約6個(gè)月,50％的膠質(zhì)母細(xì)胞瘤病例病程不足3個(gè)月。目前對(duì)膠質(zhì)瘤主要采用手術(shù)加放、化療等綜合性治療,但均不能根治,嚴(yán)重影響著人類(lèi)的健康。因此,迫切需要一種

2、新的治療方法來(lái)改善膠質(zhì)母細(xì)胞瘤患者的預(yù)后及生活質(zhì)量。目前,人們普遍認(rèn)為膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的低分化、抗調(diào)亡和高侵襲性等特點(diǎn)是其預(yù)后不良的根本因?yàn)?。在新興的基因治療的探索中,許多和腦膠質(zhì)瘤的惡性特征密切相關(guān)的基因如VEGF等被篩選出來(lái)作為治療的靶點(diǎn),然而由于體內(nèi)許多器官的正常細(xì)胞也表達(dá)該基因,使將其應(yīng)用到臨床診斷治療造成了困難。因此如果能找到一個(gè)腦膠質(zhì)母細(xì)胞瘤特異性靶基因,有望使膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的基因診療有所突破。
　　 人類(lèi)Single-m

3、inded2(SIM2)基因是人SIM家族成員之一,定位于人類(lèi)21號(hào)染色體的Down氏綜合征(21三體)臨界區(qū)域(Down Syndrome Critical Region,DSCR)。由于選擇性剪切,SIM2基因產(chǎn)物至少以?xún)煞N不同的亞型存在,SIM2-s和SIM2-1。SIM2-s和SIM2-1在肺、腎臟、骨骼肌、睪丸和扁桃體中均表達(dá),在骨髓中有低水平的SIM2-1表達(dá)。在胚胎發(fā)育過(guò)程中,SIM2-s和SIM2-1在胎心和胎腎中均表達(dá)

4、,并有研究顯示,SIM2基因?qū)Υ竽X發(fā)育和神經(jīng)元分化有重要作用。在對(duì)Down氏綜合征患者的癌癥發(fā)生率的相關(guān)研究中發(fā)現(xiàn),其罹患白血病的危險(xiǎn)性提高了20倍。在對(duì)21號(hào)染色體的進(jìn)一步研究中發(fā)現(xiàn),其中的SIM2基因可能參與了腫瘤的發(fā)生。有一系列的研究證實(shí),SIM2基因在結(jié)腸癌、前列腺癌和胰腺癌腫瘤組織、轉(zhuǎn)移灶和細(xì)胞系中均有高表達(dá),而在相應(yīng)的正常組織中則不表達(dá),并且SIM2-s的表達(dá)在結(jié)腸癌和前列腺癌中有時(shí)期特異性的特點(diǎn)。在一個(gè)103例前列腺癌病人

5、的單變量生存期分析中,腫瘤組織的陽(yáng)性SIM2-s表達(dá)與減少的生存期密切相關(guān)。在術(shù)前血清PSA、組織學(xué)分級(jí)、病理分期和SIM2-s表達(dá)的單變量分析中,只有組織學(xué)分級(jí)和SIM2-s表達(dá)與生存期顯著相關(guān)。有研究證實(shí),人膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系T98G強(qiáng)烈表達(dá)SIM2-s,提示SIM2-s可能與人腦膠質(zhì)母細(xì)胞瘤惡性特征相關(guān)。我們查閱文獻(xiàn)未見(jiàn)有SIM2-s與人腦膠質(zhì)瘤相關(guān)性的研究報(bào)道。因此考慮可以以SIM2-s為研究對(duì)象,觀(guān)察其在腦膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系及

6、臨床標(biāo)本中的表達(dá)情況,并通過(guò)一系列實(shí)驗(yàn)檢測(cè)其在膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖和侵襲中的作用,從而探討其在腦膠質(zhì)瘤治療中的意義。
　　 目前基因阻斷主要包括以下幾種策略:顯性負(fù)性調(diào)節(jié),反義核苷酸,生化制劑,雙鏈或單鏈誘騙寡核苷酸,RNA干擾技術(shù)等。RNA干擾是基因轉(zhuǎn)錄后沉默的一種方式,是生物界古老而且進(jìn)化的高度保守的現(xiàn)象之一。RNA干擾是通過(guò)小干擾RNA介導(dǎo)的特異性高效抑制基因表達(dá)途徑,由小干擾RNA介導(dǎo)識(shí)別并靶向切割同源性靶mRNA。由于使用R

7、NA干擾技術(shù)可以特異性剔除或關(guān)閉特定基因的表達(dá),所以該技術(shù)已被廣泛用于探索基因功能和傳染性疾病及惡性腫瘤的基因治療領(lǐng)域。本課題旨在研究和探討應(yīng)用RNA干擾技術(shù)靶向性抑制SIM2-s基因的表達(dá)導(dǎo)致人腦膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞侵襲性的變化和機(jī)制。研究?jī)?nèi)容分為以下三個(gè)部分。
　　 一、人腦膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞及組織中SIM2-s的表達(dá)研究
　　 目的：
　　 檢測(cè)人腦膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系以及臨床標(biāo)本中SIM2-s的表達(dá)情況,為針對(duì)S

8、IM2-s治療膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的實(shí)驗(yàn)研究奠定基礎(chǔ)。
　　 方法
　　 1、RT-PCR和Western印跡方法檢測(cè)人腦膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系T98G和U251中SIM2-s的表達(dá)情況。
　　 2、RT-PCR、Western印跡方法和免疫組化法檢測(cè)115例臨床標(biāo)本中SIM2-s的表達(dá)情況。其中63例膠質(zhì)瘤,21例腦膜瘤,23例垂體腺瘤,8例正常腦組織。63例膠質(zhì)瘤中膠質(zhì)母細(xì)胞瘤為43例。并對(duì)其表達(dá)情況進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

9、r>　　 結(jié)果：
　　 1、人腦膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系T98G和U251中存在SIM2-s的表達(dá)。
　　 2、SIM2-s特異性表達(dá)于人腦膠質(zhì)瘤標(biāo)本特別是膠質(zhì)母細(xì)胞瘤標(biāo)本中,而其它常見(jiàn)腦腫瘤(如腦膜瘤和垂體腺瘤)及正常腦組織則不表達(dá)。其中,星形細(xì)胞瘤標(biāo)本中SIM2-s的mRNA陽(yáng)性率和蛋白陽(yáng)性率分別為7.7％和15.4％,間變性星形細(xì)胞瘤標(biāo)本為14.3％和14.3％,而膠質(zhì)母細(xì)胞瘤標(biāo)本為41.9％和60.5％。
　　

10、 結(jié)論：
　　 1、人腦膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系T98G和U251中存在SIM2-s的表達(dá),可以作為本課題的研究對(duì)象。
　　 2、人腦膠質(zhì)瘤組織中存在SIM2-s的表達(dá),并且隨著膠質(zhì)瘤惡性程度的增高,SIM2-s的表達(dá)陽(yáng)性率也增高,而其它常見(jiàn)腦腫瘤和正常腦組織則不表達(dá),提示SIM2-s的表達(dá)具有膠質(zhì)瘤特異性,并且與膠質(zhì)瘤的惡性程度相關(guān)。為通過(guò)抑制SIM2-s的表達(dá)來(lái)研究膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的基因治療奠定了基礎(chǔ)。
　　 二、小

11、干擾RNA技術(shù)沉默SIM2-s的表達(dá)對(duì)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞增殖和侵襲性的影響
　　 目的：
　　 研究陽(yáng)離子脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染SIM2-s小干擾RNA的效果和效率,檢測(cè)轉(zhuǎn)染SIM2-s小干擾RNA對(duì)人腦膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系中SIM2-s的沉默效果,檢測(cè)SIM2-s小干擾RNA沉默SIM2-s后對(duì)人腦膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞增殖的影響,檢測(cè)SIM2-s小干擾RNA沉默SIM2-s后對(duì)人腦膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞侵襲性的影響。
　　 方法

12、　　 1、應(yīng)用陽(yáng)離子脂質(zhì)體LipofectamineTM2000介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染法將熒光小干擾RNA轉(zhuǎn)染導(dǎo)入人腦膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系T98G和U251內(nèi),并在熒光顯微鏡下觀(guān)察轉(zhuǎn)染效果和效率。
　　 2、應(yīng)用陽(yáng)離子脂質(zhì)體LipofectamineTM2000介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染法將三條人工合成的SIM2-s小干擾RNA序列轉(zhuǎn)染入人腦膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系T98G和U251內(nèi),并于24小時(shí)后收集細(xì)胞進(jìn)行總RNA提取及RT-PCR擴(kuò)增,檢測(cè)三條SIM2-

13、s小干擾RNA序列的干擾效果。
　　 3、RT-PCR和Western印跡方法檢測(cè)轉(zhuǎn)染SIM2-s小干擾RNA之后人腦膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系T98G和U251中SIM2-s的表達(dá)變化。
　　 4、細(xì)胞計(jì)數(shù)法和MTT方法檢測(cè)轉(zhuǎn)染SIM2-s小干擾RNA之后人腦膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系T98G和U251增殖情況的變化。
　　 5、Transwell方法檢測(cè)轉(zhuǎn)染SIM2-s小干擾RNA之后人腦膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系T98G和U251

14、侵襲能力的變化。
　　 結(jié)果：
　　 1、應(yīng)用陽(yáng)離子脂質(zhì)體LipofectamineTM2000介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染技術(shù),能夠?qū)晒鈙iRNA高效轉(zhuǎn)染入人腦膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞。
　　 2、三條SIM2-s小干擾RNA序列均能夠有效地沉默人腦膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系T98G和U251中SIM2-s的表達(dá),其中以序列3干擾效果最好,序列3 SIM2-s小干擾RNA能夠降低目的基因60％-80％的mRNA轉(zhuǎn)錄水平和40％-50％的蛋白表

15、達(dá)水平。
　　 3、轉(zhuǎn)染SIM2-s小干擾RNA之后,沒(méi)有發(fā)現(xiàn)人腦膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系T98G和U251增殖能力的變化。
　　 4、轉(zhuǎn)染SIM2-s小干擾RNA之后,人腦膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系T98G和U251侵襲能力明顯下降。
　　 結(jié)論：
　　 1、應(yīng)用陽(yáng)離子脂質(zhì)體LipofectamineTM2000介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染技術(shù),能夠?qū)晒鈙iRNA高效轉(zhuǎn)染入人腦膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞,因此亦能夠?qū)IM2-s小干擾RNA高

16、效轉(zhuǎn)染入人腦膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞。
　　 2、序列3 SIM2-s小干擾RNA能夠有效地沉默人腦膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞中SIM2-s的表達(dá),后續(xù)實(shí)驗(yàn)將以序列3小干擾RNA為干擾試劑。
　　 3、沉默SIM2-s的表達(dá)之后,對(duì)于人腦膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞的增殖沒(méi)有明顯的影響。
　　 4、沉默SIM2-s的表達(dá)之后,對(duì)于人腦膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞的侵襲性有明顯的抑制作用。
　　 三、小干擾RNA技術(shù)沉默SIM2-s的表達(dá)抑制膠質(zhì)母

17、細(xì)胞瘤細(xì)胞侵襲性的機(jī)制研究
　　 目的：
　　 檢測(cè)在RNA干擾技術(shù)沉默掉SIM2-s后侵襲性相關(guān)基因如基質(zhì)金屬蛋白酶-2(MMP-2)、MMP-9、組織金屬蛋白酶抑制因子-1(TIMP-1)和TIMP-2等的表達(dá)變化情況,探討導(dǎo)致膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞侵襲性下降的相關(guān)機(jī)制。
　　 方法
　　 1、RT-PCR和Western印跡方法檢測(cè)在轉(zhuǎn)染SIM2-s小干擾RNA后侵襲性相關(guān)基因MMP-2、MMP-9、TI