精卵發(fā)生特異性轉(zhuǎn)錄因子SOHLH1的DNA結(jié)合序列分析研究.pdf

1、本研究運用分子生物學(xué)基本技術(shù),擴增目的序列,構(gòu)建pGEX-SOHLH1融合表達質(zhì)粒,并運用IPTG誘導(dǎo)目的蛋白表達。通過純化包涵體,對包涵體內(nèi)蛋白透析復(fù)性,用GST Bind Resin親和層析純化獲得重組蛋白。最后運用靶序列循環(huán)擴增(The Cyclic Amplification of Sequence of Target,CAST)實驗來確定SOHLH1的DNA結(jié)合序列。對生殖細胞特異轉(zhuǎn)錄因子sohlhl DNA結(jié)合序列的分析為進

2、一步研究精卵發(fā)生中SOHLH1的表達調(diào)控和后續(xù)精卵發(fā)生中的基因表達調(diào)控過程奠定基礎(chǔ)。另一方面還為我們對精原卵原細胞早期分化過程進行人為干擾提供了選擇,通過人為的干擾可以獲得一些不孕不育的動物模型,從而為生殖醫(yī)學(xué)技術(shù)的發(fā)展提供新的研究思路。
　　 方法：
　　 本實驗通過PCR的方法,擴增并回收SOHLH1蛋白中螺旋環(huán)螺旋結(jié)構(gòu)域基因序列,將目的片段插入到原核表達質(zhì)粒pGEX-4T-2的GST基因下游,構(gòu)建GST-SOHLH

3、1融合表達質(zhì)粒,并轉(zhuǎn)化Rosetta-gami(DE3)Plys表達菌株。通過酶切鑒定及DNA測序篩選正確的融合表達載體。通過在不同溫度、不同IPTG終濃度及不同誘導(dǎo)時間條件下對誘導(dǎo)菌體聚丙烯酰胺凝膠電泳結(jié)果的分析,得出最佳誘導(dǎo)條件。在最適條件下對菌體進行誘導(dǎo),經(jīng)裂解、透析復(fù)性得到溶解蛋白,該蛋白經(jīng)GST Bind Resin親和層析,獲取純化后的GST-SOHLH1蛋白,并對蛋白進行Western Blot鑒定。鑒定后的GST-SOH

4、LH1蛋白用于CAST實驗,通過比對CAST實驗得到的PCR產(chǎn)物的序列,得出SOHLH1蛋白的DNA結(jié)合序列。
　　 結(jié)果：
　　 1、PCR擴增得到的Sohlh1基因片段酶切后與pGEX-4T-2連接。通過酶切及DNA測序證實目的片段成功插入到表達載體中。
　　 2、經(jīng)驗證重組質(zhì)粒在37℃、IPTG終濃度1mMol/L,誘導(dǎo)3小時時融合蛋白表達量最高,GST-SOHLH1融合蛋白分子量約為36KDa。
　

5、　 3、GST-SOHLH1蛋白以包涵體形式存在,經(jīng)裂解、透析復(fù)性得到溶解蛋白,該蛋白經(jīng)GST Bind Resin親和層析,獲取純化后的GST-SOHLH1蛋白。
　　 4、DNA序列GACTT/G/CA出現(xiàn)頻率最高,可能是SOHLH1的結(jié)合序列。
　　 結(jié)論：
　　 1、成功構(gòu)建插入小鼠SOHLH1蛋白螺旋環(huán)螺旋結(jié)構(gòu)域基因序列的重組原核表達質(zhì)粒pGEX-SOHLH1。
　　 2、經(jīng)CAST實驗證明D