特異性結(jié)合HBV EnhⅠ的人工轉(zhuǎn)錄因子在體外抑制HBV的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：設(shè)計(jì)可特異性識(shí)別并靶向作用于HBV增強(qiáng)子I（EnhⅠ）的人工轉(zhuǎn)錄因子（Artificial Transcription Factor，ATF），通過(guò)ATF靶向作用于HBV EnhⅠ來(lái)抑制HBV DNA的復(fù)制與表達(dá)，為防治HBV提供新的技術(shù)方法和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　方法：1.通過(guò)基因工程和生物信息學(xué)方法分析、對(duì)比 HBV EnhⅠ序列后確定最佳靶序列。設(shè)計(jì)能特異性結(jié)合HBV EnhⅠ最佳靶序列的ATF并構(gòu)建其真核表達(dá)質(zhì)粒載體pcD

2、NA3.1-ATF；2.將真核表達(dá)質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)染 HepG2細(xì)胞，通過(guò)酶切鑒定重組質(zhì)粒的正確性,使用免疫熒光和Western-blot方法檢測(cè) ATF在真核細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)情況；3.將真核表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染 HepG2.2.15細(xì)胞，使用CCK-8檢測(cè)ATF對(duì)細(xì)胞增殖的影響，使用 ELISA、qRT-PCR方法檢測(cè) ATF對(duì) HBV DNA復(fù)制與表達(dá)的抑制作用。
　　結(jié)果：1.將pcDNA3.1-ATF轉(zhuǎn)染 HepG2細(xì)胞后，使用免疫熒光和W

3、estern-blot檢測(cè)ATF蛋白能夠正常表達(dá)。2.將真核表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HepG2.2.15細(xì)胞后，通過(guò)CCK-8檢測(cè)說(shuō)明 ATF對(duì)細(xì)胞增殖生長(zhǎng)無(wú)明顯的毒性作用, ELISA檢測(cè)顯示細(xì)胞中 HBeAg分泌量明顯減少，熒光定量PCR檢測(cè)顯示細(xì)胞內(nèi)HBV mRNA含量減少。實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)顯示細(xì)胞內(nèi)HBV DNA拷貝數(shù)明顯下降。
　　結(jié)論：人工設(shè)計(jì)的可特異性結(jié)合于HBV EnhⅠ的ATF在真核細(xì)胞內(nèi)正常表達(dá)，在HepG2.2.1