改良HBV型特異性引物PCR基因分型方法的建立與應用.pdf

1、我國是乙型肝炎病毒(HBV)感染高發(fā)區(qū)，乙型病毒性肝炎嚴重威脅人類的生命健康。依據HBV全基因組序列同源性≥92％或S基因序列同源性≥96％將HBV分為了A-H 8種基因型。HBV的基因型是由長期病毒突變和宿主的篩選累積形成的結果。目前的研究顯示，不同基因型HBV在流行病學特征、病毒變異、疾病表現和治療應答等方面均存在著差異， HBV 的基因分型研究對進一步明確乙型肝炎發(fā)病機理、提高檢測效率、尋找治療對策和實現流行病學控制具有重要意義。

2、現有的HBV基因分型檢測方法主要有測序分型法、型特異性引物PCR基因分型法、PCR-RFLP分型法和單克隆抗體ELISA分型法等。其中，型特異性引物PCR基因分型法是一種簡單、快速、經濟的分型方法，具有良好的應用價值。型特異性堿基是該分型方法特異性的保證，由于HBV及其基因型的流行具有顯著的地域差異性，不同地域HBV基因組上型特異性堿基的分布情況以及不同地域相同基因型HBV的相同型特異性堿基位點的特異度也可能存在差異，因此，直接將國外現

3、有的型特異性引物PCR基因分型法在國內應用缺乏科學依據，評估型特異性引物的設計合理性以及所建立分型體系的地域適用性顯得相當重要。但目前尚缺乏系統、有效的型特異性引物設計標準與評估體系，所以改良現有型特異性引物設計標準以及評估體系，明確分型系統的適用地域，建立一套靈敏、準確、快速、經濟、國內適用的改良HBV型特異性引物PCR基因分型體系對于國內HBV基因型的相關研究具有重要意義。 目的：本研究旨在改進現有型特異性引物PCR基因分型

4、法的引物設計標準與方法評估體系，明確方法的適用地域，建立一種靈敏、準確、快速、經濟、國內適用的改良HBV型特異性引物PCR基因分型法。 方法： 1、改良HBV B、C基因型型特異性引物PCR分型法的建立：自GeneBank數據庫中收集已明確基因型的HBV全基因組標準序列，設立型特異性堿基相關的定義與判斷標準，利用DNAman軟件對標準序列進行比對，得到各型HBV S 基因上的所有型特異性堿基，尋找型特異性堿基聚集區(qū)，在聚

5、集區(qū)上設計型特異性引物，利用標準B、C基因型HBV血清作為陽性模板初步建立B、C基因型HBV型特異性引物PCR基因分型法。開展方法學評價實驗，包括PCR反應條件優(yōu)化、靈敏度實驗、重復性實驗和特異性實驗。利用22例臨床樣品，將該法與HBV基因分型“金標準”方法測序分型法進行方法比對，同時利用血清樣品測序結果對本法進行方法學設計評估。 2、兩套HBV型特異性引物分型體系的比較：依據參考文獻提供的型特異性分型引物建立經典型特異性引物P

6、CR基因分型法(以下簡稱“經典法”)。利用22例臨床樣品，將經典法與改良型特異性引物PCR基因分型法(以下簡稱“改良法”)進行方法學設計和性能的比對。 3、改良HBV型特異性引物PCR基因分型法的初步應用：利用改良型特異性引物：PCR基因分型法對187例廣東省內HBV DNA陽性的慢性乙型肝炎病人血清進行分型檢測。 結果： 1、利用B基因型HBV S基因上的型特異性堿基(nt321 A，nt324T，nt330

7、G)和C基因型HBV S基因上的型特異性堿基(nt293 A，nt294C，nt300 C)成功建立了改良HBV B、C基因型特異性引物PCR分型法。檢測比對血清盤，改良法與測序分型法的檢測符合率為100％。國內B基因型HBV S 基因上型特異性堿基的分布情況和堿基特異性指標與由收集的標準序列分析得到的B基因型特異性堿基分布情況和堿基特異性指標存在顯著性差異(P≤0.05)，而C基因型無顯著性差異(P≥0.05)。 2、檢測比對

8、血清盤，改良法與對照法的結果符合率為86％。 3、收集自廣東省的187份慢性乙型肝炎病人血清中，改良法成功分型185例、2例擴增未檢出。185例已分型樣品中B型107例(57.2％)、C型70例(37.4％)、BC混合型8例(4.3％)。 結論： 本研究成功建立了一種改良HBV型特異性引物PCR基因分型方法，其具有靈敏、準確、快速、經濟、國內適用等特點。本改良方法并被初步應用于廣東省內HBV基因型流行情況的調查。