用于診斷孢子絲菌病的特異性探針和引物的篩選及孢子絲菌基因分型的比較.pdf

1、申克氏孢子絲菌是孢子絲菌病的致病菌，主要引起皮膚、皮下組織和附近淋巴系統(tǒng)的亞急性和慢性感染，偶可播散至骨骼和內(nèi)臟，甚至發(fā)生全身的播散性感染。孢子絲菌病在世界范圍內(nèi)廣泛分布。目前該病的診斷較為困難。已見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道的孢子絲菌相對(duì)特異性引物和探針為孢子絲菌病的分子生物學(xué)診斷奠定了基礎(chǔ)，但尚無(wú)資料對(duì)各種引物和探針進(jìn)行過(guò)系統(tǒng)地比較。真菌傳統(tǒng)的分型方法主要依賴菌體培養(yǎng)和鏡下的形態(tài)學(xué)觀察，而申克氏孢子絲菌具有“表型特征基本一致”的特點(diǎn)，因此，利用分子生

2、物學(xué)方法對(duì)其進(jìn)行基因分型就顯示出一定的優(yōu)勢(shì)。曾用于申克氏孢子絲菌種內(nèi)分型的分子生物學(xué)方法有隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA分析(RAPD)、mtDNA的限制性內(nèi)切酶多態(tài)性分析(RFLP)及核糖體基因限制性內(nèi)切酶多態(tài)性分析(rDNA RFLP)與Southern blotting雜交相結(jié)合等方法。本研究旨在以相同的孢子絲菌菌株為樣本，對(duì)以上3種方法進(jìn)行比較，以確定在基因分型上哪種方法相關(guān)性更好、分辨力更強(qiáng)，并篩選出對(duì)孢子絲菌更敏感和更特異的探針和引物

3、，為從基因水平上快速、準(zhǔn)確診斷孢子絲菌病奠定基礎(chǔ)。 材料與方法： 1．以50株純培養(yǎng)的孢子絲茵及標(biāo)準(zhǔn)株為樣本，以毛霉、煙曲霉、白色念珠菌各1株為陰性對(duì)照，通過(guò)對(duì)基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，對(duì)已見(jiàn)報(bào)道的4對(duì)孢子絲菌特異性引物進(jìn)行篩選，引物分別為針對(duì)18SrRNA的SS3-SS4、幾丁質(zhì)合成酶基因Ⅰ的S2-R2、拓?fù)洚悩?gòu)酶基因Ⅱ的SSHF31-SSHR97及ITS Ⅱ區(qū)的ITS3-SSP。結(jié)果以PCR產(chǎn)物在1﹪瓊脂糖凝膠電泳

4、上出現(xiàn)與標(biāo)準(zhǔn)株同一水平的亮光帶型為陽(yáng)性，對(duì)照菌株不出現(xiàn)陽(yáng)性條帶的引物即為特異性引物。進(jìn)一步對(duì)陽(yáng)性的模板倍比稀釋，再以特異的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，以DNA模板濃度最低且?guī)完?yáng)性者為更特異、更敏感的引物。 2.菌株樣本同上，用PCR-ELISA的方法對(duì)已見(jiàn)報(bào)道的5個(gè)孢子絲菌特異性探針進(jìn)行篩選，探針?lè)謩e為針對(duì)28SrRNA的U26852、U26866、U26866’，針對(duì)18SrRNA的M85053及針對(duì)ITSⅡ區(qū)的AF11794.5。

5、底物顯色者為陽(yáng)性，依據(jù)顯色強(qiáng)弱及光密度值大小進(jìn)行定性定量分析，從而判斷探針的敏感性和特異性。 3.在本教研室先前進(jìn)行的“rDNA RFLP．S0uthern blotting雜交”分型的基礎(chǔ)上，選擇與其相同的32株孢子絲菌為樣本，將菌株的mtDNA以限制性內(nèi)切酶HaeⅢ酶切進(jìn)行RFLP分型，同時(shí)以隨機(jī)引物OPAA11對(duì)菌株的基因組DNA PCR擴(kuò)增進(jìn)行RAPD分型，對(duì)電泳帶型進(jìn)行分析，進(jìn)一步對(duì)三種分型方法進(jìn)行比較。 結(jié)果

6、： 1.在同樣PCR條件下，引物S2-R2、SSHF31-SSHR97及ITS3-SSP具有較好的特異性，引物S2-R2的敏感性更高：4對(duì)引物對(duì)50株孢子絲菌均能擴(kuò)增出陽(yáng)性條帶；引物SS3-SS4對(duì)白念擴(kuò)增條帶亦為陽(yáng)性，特異性不強(qiáng)；同一模板濃度下引物SSHF31-SSHR97的敏感性不強(qiáng)。 2.在相同的雜交和ELISA條件下，50株孢子絲菌均對(duì)探針U26852顯色較強(qiáng)，對(duì)其它4個(gè)探針則顯色較弱。 3.mtDNA-

7、RFLP方法將32株受試菌株分為5型，分別對(duì)應(yīng)日本學(xué)者Ishizaki、林俊萍等在研究世界各地孢子絲菌mtDNA-RFLP基因分型中所命名的1，4，6，7，20五種基因型；RAPD方法則將受試菌株分為7種基因型，且所有菌株均具有約0.6kbp大小的共有條帶；兩種方法在孢子絲菌的基因分型與南北方分布及臨床分型的聯(lián)系方面均未表現(xiàn)出明顯相關(guān)性。 結(jié)論： 1.針對(duì)幾丁質(zhì)合成酶基因Ⅰ的引物S2-R2在目前已見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道的孢子絲菌特異