艾滋病患者合并肺孢子菌肺炎的分子診斷及肺孢子菌基因多態(tài)性研究.pdf

1、肺孢子菌肺炎（Pneumocystis jirovecii pneumonia,PCP)是免疫功能低下人群尤其是艾滋病患者中最常見的機會性感染和最主要死亡原因之一，導致 PCP的病原體是耶氏肺孢子菌（Pneumocystis jirovecii，PJ)，該病原體從1909以來一直被認為是原蟲,但在1988年證實是一種介于子囊(真)菌亞門與擔子(真)菌亞門之間的真核生物，為真菌家族的一員。臨床診斷 PCP病例依靠臨床表現(xiàn)，確診需要發(fā)現(xiàn) P

2、J的滋養(yǎng)體和/或包囊。然而，由于 PJ不能體外培養(yǎng)，一般采取染色方法進行診斷，但該方法陽性率低，操作繁瑣費時，制約了 PCP的病原學診斷，容易造成誤診和漏診。近年來，國外多項研究認為，聚合酶鏈反應（PCR）測序方法可以明顯提高 PCP診斷的敏感性與特異性，可成為診斷的金標準之一，診斷目的基因以線粒體大亞基 rRNA
　　(mtLSUrRNA)的敏感性和特異性最好。然而，國內(nèi)有關研究鮮見報道，迄今仍缺乏統(tǒng)一的分子診斷標準。有研究證實

3、，自然環(huán)境中和宿主感染的 PJ具有基因多態(tài)性，長期使用磺胺類藥物可能導致耐藥 PJ。最常用的分型序列是 mtLSUrRNA基因、rRNA基因內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(ITS)、細胞色素 B（CYB)基因、二氫蝶酸合成酶(DHPS)基因及二氫蝶酸還原酶(DHFR)基因，而后三條基因還是藥物作用靶點，可用于耐藥位點監(jiān)測。迄今為止，我國艾滋病患者 PJ感染的基因多態(tài)性仍是個謎，其潛在耐藥位點也未明了。因此，本研究擬在我國南方地區(qū)艾滋病合并肺部感染患者中應

4、用PCR方法，探討其診斷 PCP的價值；同時，了解我國南方地區(qū)艾滋病合并 PCP患者 PJ感染的基因多態(tài)性、基因分型及潛在耐藥位點。
　　研究目的：
　　1.探討 PCR方法在診斷艾滋病合并 PCP中的價值，以提高 PCP的病原學診斷率。
　　2.分析我南方地區(qū)艾滋病合并 PCP患者 PJ感染的基因多態(tài)性、基因分型及潛在耐藥位點，以了解該地區(qū)艾滋病患者 PCP的分子流行病學特點。
　　研究內(nèi)容：
　　1.收

5、集2012年1月至2014年9月在我院收治的具有肺部感染的158例 AIDS患者臨床資料，包括：性別、年齡、CD4細胞數(shù)值、有無使用過 HARRT治療、有無使用磺胺類藥物、是否為初次感染、預后情況等。以158例患者為入組對象，建立臨床資料數(shù)據(jù)庫。
　　2.收集入組患者 BALF，提取 PJ-DNA后，將 PJ-mtLSU rRNA作為目的基因采用PCR方法進行擴增，成功擴增出 PJ-DNA并通過測序得到 mtLSU rRNA基因位

6、點序列可診斷 PCP，統(tǒng)計采用PCR法診斷 PCP的例數(shù)得到檢測率。結合本研究入組對象的臨床資料以及 GMS染色的結果，并將確診 PCP的患者作為研究對象，比較確診 PCP患者均采用PCR法與 GMS染色法這兩種診斷方法得到的結果，分析結果并總結 PCR作為 PCP的分子診斷方法的意義。
　　3.基因多態(tài)性分析：針對PCR方法得到的PJ-mtLSU rRNA陽性標本，再進行4個基因的擴增。然后對5個基因產(chǎn)物（包括mtLSU rRN

7、A基因、DHPS基因、DHPS基因、ITS基因、CYB基因）進行測序分析，確定各個基因分型。通過GenBank中原型序列比較有無新型序列的發(fā)現(xiàn)，本研究結果數(shù)據(jù)采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學處理，兩組定性資料的比較采用卡方檢驗（χ2 Test），P<0.05表示差異具有統(tǒng)計學意義。
　　研究對象及研究方法：
　?。?）研究對象：
　　以2012年1月至2014年9月我院收治的具有肺部感染的158例 AIDS患者的

8、肺泡灌洗液（BALF）作為研究對象，各種診斷參考本文研究方法的診斷標準。
　　（2）研究方法
　　1）收集研究對象的臨床資料，建立臨床資料的數(shù)據(jù)庫。
　　2）針對研究對象提取 PJ-DNA后運用PCR方法擴增目的基因 mtLSU rRNA，其中PCR能夠擴增出 mtLSU rRNA基因的確定為 PCR診斷 PCP陽性。參考回顧性分析的臨床資料得到臨床診斷為 PCP的例數(shù)，同時對研究對象中采用GMS染色法診斷為 PCP的

9、例數(shù)以及采用PCR測序法診斷為 PCP的例數(shù)進行統(tǒng)計。并以臨床診斷+PCR測序/GMS染色法確診 PCP的患者作為研究對象，采用PCR法與 GMS染色法兩種方法檢測確診 PCP患者的檢測率進行比較。
　　3）對于成功擴增出 PJ-mtLSU rRNA的陽性標本，繼續(xù)擴增 DHPS基因、DHPS基因、ITS基因、CYB基因這四個基因。然后結果去測序、對測序結果進行分析、將得到的分型與 Genbank里面的原型進行比對。
　　4

10、）本研究結果數(shù)據(jù)采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學處理，兩組定性資料的比較用卡方檢驗（χ2 Test），P<0.05表示差異具有統(tǒng)計學意義。=
　　研究結果：
　?。?）在2012年1月至2014年9月期間收治在廣州市第八人民醫(yī)院的158例 AIDS合并肺部感染的患者中采用PCR方法成功檢測出PJ例數(shù)有56例，占總例數(shù)的35.4％。結果表示 PCR方法診斷 PCP檢測率為35.4%.
　　（2）158例 AIDS合

11、并肺炎患者中臨床診斷 PCP的例數(shù)為51，占總例數(shù)的32.2%；GMS染色鏡檢診斷 PCP的例數(shù)31例，占總例數(shù)的19.6%；PCR診斷 PCP的例數(shù)56，占總例數(shù)的35.4%。將確診為 PCP的51例標本作為研究對象，比較其運用PCR方法與 GMS染色鏡檢這兩種方法得到的診斷 PCP的例數(shù)，同時比較這兩種方法的敏感性，探討 PCR方法運用于 PCP診斷的意義。經(jīng)卡方檢驗得出結論是 PCR法的敏感性高于 GMS染色法（P=0.000）。

12、
　?。?）以mtLSU rRNA為目的基因擴增出的 PJ陽性例數(shù)有56例，比對 Genbank里面的原型序列，均符合原型在85、248的2個位點分型，一共分為5型，各型的比例分別是基因型1型占23%、基因型2型占23%、基因型3型占16%、基因型4型占34%、基因型5型占4%。沒有發(fā)現(xiàn)新的基因型。
　?。?）針對研究對象以DHFR、DHPS、ITS、CYB四個基因為目的基因繼續(xù)采用PCR技術檢測 PJ，以DHFR為目的基因

13、成功擴增出38個 PJ陽性樣本，通過與基因庫的 PJ參考序列進行比對發(fā)現(xiàn) DHFR具有多態(tài)性，當中12例樣本在312位點是有混合 PJ株感染，1例在188位點有混合 PJ株感染，未發(fā)現(xiàn)新型基因型及耐藥相關的位點突變。以DHPS為目的基因成功擴增出40個 PJ陽性樣本，通過與基因庫的 PJ參考序列進行比對發(fā)現(xiàn) DHPS具有多態(tài)性，當中有3例在耐藥相關位點163、169有發(fā)生堿基突變，其他均與原型一致，未發(fā)現(xiàn)新型基因。以ITS為目的基因成功

14、擴增出53個 PJ陽性樣本，獲得53條 ITS1和53條 ITS序列，通過與基因庫的 PJ參考序列進行比對獲得 ITS1基因型8型（A、B、D、E、G、I、SYD、DELIr）和4條新序列；ITS2基因型7型（b、e、g、h、p、i、r）和4條新序列，一共獲得14種組合序列，當中“BTM4g、BTM1i”是新發(fā)現(xiàn)的組合型，之前沒有報道過；Eg是最常見的 ITS基因型；ITS基因比較復雜具有明顯多態(tài)性。以CYB為目的基因成功擴增出51個

15、PJ陽性樣本，通過與基因庫的 PJ參考序列進行比對，發(fā)現(xiàn)與已知基因型相符的有44例，分別有 CYB1型25個、CYB2型13個、CYB5型2個、CYB8型4個，CYB10、CYB11、CYB12是本研究新發(fā)現(xiàn)的基因型，分別有4個、3個、1個，其中標本69是 CYB8型和新基因型的混合感染。
　?。?）將獲得的新基因型納入 GenBank，獲得登錄號。擴大了我國用于 PJ分型的樣本量，為進一步了解我國 PJ的種群特征和進化情況。

16、r>　　研究結論：
　　1.本研究結果表明 AIDS合并肺部感染的人群中運用PCR診斷為 PCP的陽性率高，提示在我國南方地區(qū)肺孢子菌肺炎仍然是 AIDS患者的常見的機會性感染之一。
　　2.對于 PCP診斷的實驗方法，PCR法比傳統(tǒng)的 GMS染色法的敏感性高，對樣本采集的要求低，優(yōu)點多，可以推廣用于 PCP的實驗室診斷?？捎糜诜肿訖z測、流行病學調(diào)查，并可為篩選 AIDS患者中PCP高風險人群提供參考依據(jù)。所用PJ-mtLS

17、U rRNA的引物對 PJ高度敏感。序列分析結果表示該基因比較保守，突變少同源性大，與國內(nèi)外研究結果基本一致，可以推廣用于我國肺孢子菌的檢測和流行病學等研究。
　　3.我國南方地區(qū) AIDS感染人群中肺孢子菌的基因具有多態(tài)性，其中mt LSUrRNA基因型在85和248的2個位點共分為5型。我國廣州地區(qū)該基因型的分布以基因型4型占首位，比例為34%；其次是基因型1型和基因型2型，比例均為23%。
　　4. ITS基因是分析

18、PJ基因多態(tài)性的良好位點。獲得53條序列，共14種組合序列，Eg是最常見基因型，其中“BTM4g、BTM1i”是新發(fā)現(xiàn)的組合型。
　　5. CYB基因型發(fā)現(xiàn)3種不同于原型序列的新序列，分別被命名為 CYB10型、CYB11型、CYB12型，沒有檢測到與文獻報道的藥物靶位基因的突變。
　　6.我國南方地區(qū) AIDS合并肺部感染人群中肺孢子菌 DHPS和DHFR基因型耐藥相關位點的突變率低，可能與廣州地區(qū)人群對于常見的上呼吸道感