申克孢子絲菌線粒體DNA型別與臨床分型的關(guān)系.pdf

1、目的：用常規(guī)真菌學(xué)方法比較不同臨床型別的申克孢子絲菌分離株的真菌學(xué)特點(diǎn)，并了解中國遼寧地區(qū)的申克孢子絲菌線粒體DNA分型，探索其線粒體DNA分型與臨床表現(xiàn)型之間的關(guān)系。 材料與方法： 一、實(shí)驗(yàn)菌株 47例皮膚型孢子絲菌病患者均來自于本院皮膚科，皮損處組織塊或膿汁培養(yǎng)的致病菌經(jīng)大培養(yǎng)菌落形態(tài)特征和小培養(yǎng)鏡下特點(diǎn)鑒定為申克孢子絲菌，其中男16例，女31例，年齡2~86歲；固定型24例，淋巴管型23例。 二、實(shí)

2、驗(yàn)試劑 1、菌體培養(yǎng)基 (1)沙氏葡萄糖蛋白胨瓊脂固體培養(yǎng)基； (2)改良沙氏液基。 2、線粒體DNA提取試劑 (1)EDTA緩沖液；(2)破壁酶Zymolyase 100T；(3)2-巰基乙醇；(4)20％SDS(十二烷基磺酸鈉)；(5)Tris飽和酚；(6)氯仿、異丙醇、無水乙醇；(7)TE緩沖液。 3、酶切及電泳試劑 (1)HaeⅢ酶；(2)RNaseA酶；(3)瓊脂糖；(4

3、)0.5×TBE儲存液。 三、主要實(shí)驗(yàn)儀器 1、蒸汽高壓消毒箱(美國Tuttnauer 2540MK型)； 2、PH4000AB型電熱恒溫培養(yǎng)箱(天津市泰斯特儀器有限公司)； 3、紫外凝膠成像系統(tǒng)(英國Gel worker eD，UVP GDS 8000)； 4、全能型高性能臺式冷凍離心機(jī)(德國Heaeus，Biofuge Stratos)； 5、05RP-22離心機(jī)(Hitachi提供)

4、； 6、HZO-X100震蕩培養(yǎng)箱(哈爾濱市東聯(lián)電子開發(fā)有限公司)； 7、電泳儀(北京六一儀器廠，DYY-Ⅲ2型)； 8、電泳槽(北京六一儀器廠，DYY-Ⅲ2型)； 9、超聲細(xì)胞破碎儀(up 50H ultraschallprozessor)。 四、實(shí)驗(yàn)方法 1、菌株培養(yǎng)將47株分離菌株分別接種于沙氏葡萄糖蛋白胨瓊脂(SDA)固體培養(yǎng)基，2周后于菌體培養(yǎng)及鏡下觀察形態(tài)。 2、線粒體

5、DNA提取3、限制性酶切4、瓊脂糖凝膠電泳并照相結(jié)果1、菌體培養(yǎng)將47株孢子絲菌病分離菌株接種于沙氏葡萄糖蛋白胨瓊脂固體培養(yǎng)基，觀察發(fā)現(xiàn)47株申克孢子絲菌菌株基本一致： (1)SDA固體培養(yǎng)基示：1周時(shí)呈直徑約0.5cm菌落，淡褐色或白色平滑酵母樣菌落，表面濕潤成膜狀。2周時(shí)菌落直徑約2cm，中央凹陷，周邊隆起，出現(xiàn)皺褶，呈深褐色。 (2)鏡下示：細(xì)長分隔菌絲，分生孢子柄多與菌絲呈直角生長，頂端著生梨形或卵圓形孢子，呈梅

6、花辦狀分布，并見孢子沿菌絲側(cè)生。 2、線粒體DNA分型對47株申克孢子絲菌進(jìn)行線粒體DNA分型，得4，5，6，20及24型共五種帶型，由8或9條帶組成。這五個(gè)型別的共有帶分別為10kb、4.5kb、3.6kb、1.9kb、1.25kb、0.86kb和0.75kb。5型與20型的區(qū)別在于5型比20型多了一條0.96kb的帶；6型與24型的區(qū)別在于二者第二條帶的位置不同，即6型的第二條帶位于8.2kb處，而24型的第二條帶位于6.4

7、kb處。 3、線粒體型別與臨床分型 (1)該47株申克孢子絲菌經(jīng)線粒體DNA分型，線粒體DNA 4型有40株，6型有3株，5型有1株，20型有1株，24型有2株。 (2)來源于臨床固定型的申克孢子絲菌菌株共有24株，4型有22株，余為6型；來源于臨床淋巴管型的申克孢子絲菌菌株共有23株，其中4型有18株，6型有1株，5型有1株，20型有1株，24型有2株。 4、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 (1)對申克孢子絲菌的線

8、粒體DNA分型和孢子絲菌病的臨床型別進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，采用x2檢驗(yàn)，P<0.1，可認(rèn)為申克孢子絲菌的臨床型別中的淋巴管型和固定型均與線粒體DNA分型中的4型相關(guān)。 (2)此外，就本實(shí)驗(yàn)中的47例患者進(jìn)行了臨床型別與性別之間的關(guān)聯(lián)假設(shè)，采用x2檢驗(yàn)，P>0.1，故可認(rèn)為申克孢子絲菌病的臨床分型(淋巴管型和固定型)與患者性別之間無相關(guān)性。 結(jié)論： 本研究用常規(guī)真菌學(xué)方法對淋巴管型和固定型孢子絲菌病的致病菌株進(jìn)行觀察比較，

9、并研究了皮膚型孢子絲菌病的致病菌線粒體DNA分型與臨床型別之間的關(guān)系，得出以下結(jié)論：①用常用真菌形態(tài)學(xué)方法無法區(qū)分來源于不同臨床型別的申克孢子絲菌分離菌株。②淋巴管型和固定型孢子絲菌病與患者性別之間無明顯相關(guān)性。③中國遼寧地區(qū)的申克孢子絲菌由4、5、6、20及24型組成，4型在遼寧地區(qū)占有絕對優(yōu)勢。④線粒體DNA分型為4型的申克孢子絲菌菌株可能與淋巴管型及固定型孢子絲菌病有關(guān)，該型菌株在體內(nèi)是否更容易引起淋巴管型和固定型皮損有待進(jìn)一步研