申克氏孢子絲菌酵母相菌絲相差異蛋白的篩選與鑒定.pdf

1、孢子絲菌病是雙相型真菌申克孢子絲菌所致的皮膚，皮下組織及其附近淋巴管的亞急性和慢性感染，主要累及四肢和顏面等暴露部位，表現(xiàn)為肉芽組織損害，偶爾累及黏膜、肺、腦膜和其他內(nèi)臟器官。孢子絲菌是腐生真菌，在世界廣泛分布，可污染土壤、蘆葦、動(dòng)物的皮毛、污水等。人類常因外傷直接接種致病。申克孢子絲菌為雙相型真菌，室溫培養(yǎng)為菌絲相，組織內(nèi)和37℃培養(yǎng)為酵母相。其酵母相能引起上述皮膚、皮下組織、黏膜和局部淋巴系統(tǒng)甚至全身多系統(tǒng)的損害，而菌絲相則不會(huì)。這

2、種雙相真菌的致病性和其雙相型的轉(zhuǎn)換密切相關(guān)。目前，對(duì)于孢子絲菌雙相轉(zhuǎn)換與致病蛋白二者關(guān)系的研究尚未見報(bào)道，而其他雙相真菌在這方面的研究有很多報(bào)道，很多蛋白被推測(cè)及鑒定出來(lái)。研究均證實(shí)了在酵母相中有差異蛋白的高表達(dá)，通過比較，我們課題組將進(jìn)一步研究申克氏孢子絲菌雙相轉(zhuǎn)換中差異蛋白的表達(dá)情況，并尋找出在其誘導(dǎo)轉(zhuǎn)換機(jī)制扮演重要角色的蛋白質(zhì)。
　　 目的：篩選孢子絲菌菌絲相酵母相差異蛋白，尋找有關(guān)雙相轉(zhuǎn)換的致病蛋白，為明確孢子絲菌的發(fā)病

3、機(jī)理及尋找靶向治療藥物奠定重要的基礎(chǔ)。
　　 材料和方法：對(duì)孢子絲菌標(biāo)準(zhǔn)株分別進(jìn)行菌絲相和酵母相的培養(yǎng)，并提取其各自的總蛋白，純化。并找出適合孢子絲菌蛋白雙相電泳的條件，進(jìn)行蛋白的分離，得出相關(guān)的蛋白圖譜，經(jīng)Pdquest軟件分析，選取相關(guān)的差異蛋白經(jīng)處理后進(jìn)行質(zhì)譜檢測(cè)，最后得到相關(guān)的具體的蛋白。
　　 結(jié)果：
　　 1、申克氏孢子絲菌25℃之后，在光鏡下可見到細(xì)長(zhǎng)的菌絲體，轉(zhuǎn)入BHI培養(yǎng)基37℃培養(yǎng)24小時(shí)后菌

4、體斷裂，48小時(shí)時(shí)完全變成單個(gè)孢子。
　　 2、在進(jìn)行孢子絲菌雙向電泳時(shí)，選擇蛋白上樣為50μg，載體兩性電解質(zhì)PH：4-6，經(jīng)2D clean-Up Kit充分純化并行考馬斯亮藍(lán)染色可獲得清晰的蛋白質(zhì)雙向電泳圖譜，適用于蛋白質(zhì)組學(xué)研究。
　　 3、孢子絲菌蛋白雙向電泳結(jié)果測(cè)得差異蛋白300多個(gè)，其中酵母相高表達(dá)的200多個(gè)，低表達(dá)的100多個(gè)。
　　 4、經(jīng)質(zhì)譜分析及NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)檢索得到可能有意義的蛋白：DR

5、K1組氨酸激酶，熱休克蛋白77伴88，肌動(dòng)蛋白，細(xì)胞色素P-450，蘇/絲氨酸激酶等以及一些假想蛋白。
　　 結(jié)論：
　　 1、孢子絲菌確實(shí)有在隨溫度變化而出現(xiàn)形態(tài)轉(zhuǎn)化，25℃為菌絲相，37℃為酵母相。
　　 2、蛋白上樣量、純化方法、載體兩性電解質(zhì)PH選擇范圍，染色方法均影響雙向電泳的結(jié)果。
　　 3、建立了孢子絲菌菌絲相酵母相的雙向電泳圖譜。
　　 4、獲得5個(gè)可能致病蛋白：Hsp70伴Hsp