白念珠菌酵母相和菌絲相細(xì)胞表達(dá)基因譜的構(gòu)建及聚類分析.pdf

1、近年來(lái)念珠菌感染已成為住院患者血行感染中第三或第四位最常見(jiàn)的病原菌，其中白念珠菌最為常見(jiàn)，占念珠菌屬40-70％。白念珠菌屬人體常居真菌，為條件致病真菌，一般以酶母相存在于機(jī)體，當(dāng)機(jī)體免疫功能受到抑制或微生態(tài)失衡時(shí)，白念珠菌會(huì)轉(zhuǎn)變其生長(zhǎng)形態(tài)，可由酵母相轉(zhuǎn)為菌絲相，進(jìn)而對(duì)機(jī)體產(chǎn)生危害。體外培養(yǎng)條件下，白念珠菌也可以酶母相形式或菌絲相形式生長(zhǎng)，這種酵母與菌絲之間的轉(zhuǎn)換稱為菌相轉(zhuǎn)換。 正因?yàn)榘啄钪榫卺t(yī)學(xué)中的重要地位，因此對(duì)其致病的機(jī)

2、制進(jìn)行了廣泛深入的研究。近年來(lái)對(duì)白念珠菌的毒力因子研究主要集中于三個(gè)方面：①粘附；②酶類；③菌相轉(zhuǎn)換。 菌相轉(zhuǎn)換，即酵母相生長(zhǎng)轉(zhuǎn)到菌絲相生長(zhǎng)的這一變化是白念珠菌感染轉(zhuǎn)變的過(guò)程，菌絲多則感染率高；另一方面，當(dāng)天然突變或人工中斷某些基因?qū)е虏荒苄纬删z的白念珠菌突變菌株，則在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中表現(xiàn)出毒力的降低或喪失，因此白念珠菌菌絲的形成與發(fā)病有一定的關(guān)系。已有的研究證實(shí)，菌絲的形成改變白念珠菌各種毒力因子的表達(dá)，致菌株毒力增加，感染性增強(qiáng)

3、。 為更全面的尋找白念珠菌酵母相和菌絲相致病相關(guān)基因及其毒力因子，本研究應(yīng)用LongSAGE技術(shù)，定性定量檢測(cè)白念珠菌酵母相和菌絲相細(xì)胞表達(dá)基因的改變，構(gòu)建白念珠菌酵母相和菌絲相細(xì)胞表達(dá)基因譜，聚類分析表達(dá)基因功能，探討酵母相和菌絲相細(xì)胞表達(dá)基因與菌相轉(zhuǎn)換、菌株毒力的相關(guān)性。 本研究選擇白念珠菌ATCC-90028作為研究菌株，經(jīng)RPMI1640體外誘導(dǎo)形成純的酵母相和菌絲相細(xì)胞作為研究材料，經(jīng)顯微鏡下計(jì)數(shù)其純度，細(xì)胞純

4、度超過(guò)95％用于提取RNA；提取純化細(xì)胞的RNA經(jīng)RT-PCR檢測(cè)，證實(shí)實(shí)驗(yàn)菌株為白念珠菌，且酵母相細(xì)胞無(wú)菌絲相細(xì)胞污染后，使用分離的RNA進(jìn)行LongSAGE標(biāo)簽庫(kù)的構(gòu)建，這種使用細(xì)胞表型分子與特異性表達(dá)基因的雙重篩選，確保RNA來(lái)源于均一性細(xì)胞，使經(jīng)LongSAGE標(biāo)簽庫(kù)分析獲得的基因表達(dá)譜，能夠代表該細(xì)胞的基因表達(dá)特征。 應(yīng)用相當(dāng)于5X107細(xì)胞的總RNA用于構(gòu)建LongSAGE標(biāo)簽庫(kù)。使用生物素化標(biāo)記的Oligo-dT磁

5、珠結(jié)合mRNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，經(jīng)大腸桿菌DNA聚合酶、DNA連接酶合成cDNA第2鏈，合成的雙鏈cDNA使用延長(zhǎng)因子與葡萄糖醛酸脫氫酶引物，PCR擴(kuò)增檢測(cè)cDNA合成的有效性。錨定酶NlaⅢ酶切雙鏈cDNA后，將標(biāo)本等分成兩份，分別使用適配子A和B與cDNA酶切后產(chǎn)物連接。連接后產(chǎn)物使用標(biāo)簽酶MmeⅠ酶切，釋放單標(biāo)簽，再將這兩種單標(biāo)簽進(jìn)行連接，得到含表達(dá)基因片段及適配子A和B的130bp雙標(biāo)簽。規(guī)?；疨CR擴(kuò)增130bp雙標(biāo)簽后，

6、在聚丙烯酰胺凝膠上進(jìn)行純化。純化后的130bp雙標(biāo)簽用NlaⅢ酶切，得到34bp雙標(biāo)簽。34bp雙標(biāo)簽相互連接后形成串聯(lián)體。將串聯(lián)體連接導(dǎo)入質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，驗(yàn)證轉(zhuǎn)化效率后，轉(zhuǎn)化克隆進(jìn)行DNA測(cè)序分析。最后提取標(biāo)簽，建立表達(dá)標(biāo)簽數(shù)據(jù)庫(kù)。本研究使用該技術(shù)共構(gòu)建2個(gè)LongSAGE標(biāo)簽庫(kù)，分別為白念珠菌酵母相和菌絲相細(xì)胞。 本研究經(jīng)過(guò)相應(yīng)改進(jìn)后，保證了LongSAGE標(biāo)簽庫(kù)的成功構(gòu)建。主要改進(jìn)有：(1)增加磁珠在磁場(chǎng)中的放置時(shí)間，

7、減少了磁珠的損失；(2)減少適配子的用量，提高了130bp雙標(biāo)簽的產(chǎn)量與特異性；(3)二次洗脫聚丙烯酰胺凝膠，使DNA的回收量增加；(4)酚氯抽提凝膠上回收的DNA，防止核酶降解，串聯(lián)體產(chǎn)量增加。 研究中獲得白念珠菌酵母相細(xì)胞LongSAGE標(biāo)簽17,769個(gè)，特異性標(biāo)簽分為7,715種，菌絲相細(xì)胞LongSAGE標(biāo)簽17,552個(gè)，特異性標(biāo)簽6,940種。從白念珠菌酵母相和菌絲相細(xì)胞LongSAGE標(biāo)簽分布狀態(tài)來(lái)看，處于不同生

8、長(zhǎng)狀態(tài)下的白念珠菌表達(dá)的基因量類似，新標(biāo)簽出現(xiàn)率較均一。白念珠菌菌相的轉(zhuǎn)換伴隨著菌絲相細(xì)胞獨(dú)特基因和部分基因的高表達(dá)，并由此導(dǎo)致白念珠菌以菌絲相生長(zhǎng)。白念珠菌菌絲相細(xì)胞高表達(dá)基因可分為四類：(1)細(xì)胞表面分子類，如CYR1、HK1、CMD1等，這些分子參與細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，推測(cè)其在菌相轉(zhuǎn)換中起介導(dǎo)細(xì)胞基因表達(dá)的調(diào)控或細(xì)胞行為的改變；(2)代謝酶類，如AY445049、TPS2等，AY445049(beta-glucosidase，B葡糖

9、苷酶)表達(dá)量的上調(diào)可增強(qiáng)對(duì)雙糖、多糖的水解，有利于葡萄糖和其它單糖的吸改；(3)結(jié)構(gòu)基因類，如18S、25sRNA基因、HWP1、CDC11等，某些結(jié)構(gòu)基因在白念珠菌菌絲相狀態(tài)下獨(dú)特表達(dá)，可能是菌相轉(zhuǎn)換的結(jié)果；(4)功能不明的細(xì)胞分子，如HIS4、SLA2、soml、AJ390523等。 白念珠菌酵母相和菌絲相細(xì)胞表達(dá)基因譜的建立有助于闡明白念珠菌菌相轉(zhuǎn)換的機(jī)制，標(biāo)簽庫(kù)中功能不明的細(xì)胞分子或有差異表達(dá)的高表達(dá)無(wú)匹配標(biāo)簽值得深入研